Cette partie du travail est constituée de deux articles. Le premier a permis de montrer le lien entre la diminution des capacités de prolifération de CSM-MO avec l’âge de donneurs et la diminution de la clonogenicité, cette étude étant réalisée après une subculture de cellules (passage 1). Le deuxième article présente un travail réalisé afin de comparer l’effet de l’âge des donneurs et du temps de culture (de passage 1 à passage 5) non seulement sur les propriétés de prolifération mais aussi de différenciation de CSM-MO. Un résumé de méthodes utilisées lors de ces deux études sera présenté pour continuer par la présentation des principaux résultats.
Culture des CSM issues de la moelle osseuse
Isolement des CSM-MO
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont isolées à partir d’échantillons de moelle osseuse (MO) prélevées chez des donneurs sains dans le cadre d'allogreffe au niveau de l’Unité de Thérapie Cellulaire et Tissulaire (UTCT) au Centre Hospitalier Universitaire (CHU) Nancy-Brabois ou lors de pose de prothèse de hanche au niveau du service de Chirurgie Orthopédique et Traumatologique (COT) au CHU de Nancy. La MO est récupérée dans un tube de PBS (Phosphate Buffer Saline) (GIBCO, réf 14190) hépariné (SIGMA, H3393-50KU) (10 unités/mL) (U/mL) pour inhiber la coagulation plaquettaire. La liste des prélèvements utilisés dans cette étude est détaillée dans l’annexe.
20 mL de milieu complet MEM (Lonza, Réf BE12-169F) sont ajoutés à la suspension de moelle osseuse, ensuite centrifugée pendant 10 minutes (min) à 300 g pour séparer les cellules des liquides (milieu de culture et sérum). Le milieu MEM (Lonza, Réf BE12-169F) est dit complet après avoir été supplémenté en sérum de veau fœtal (SVF) (10 % V/V) (SIGMA, Réf F7524), en Pénicilline/Streptomycine (10 mU/mL) (GIBCO, Réf 15070-063) et en Amphotéricine B (2,5 μg/mL) (GIBCO, Réf 15290-026). Du milieu complet MEM est à nouveau ajouté, puis seules les cellules mononuclées sont comptées sur cellule de Thoma et mises en culture. Pour cela, 190 μL d'une solution de Leucoplate (SOBIODA, Réf W3102.002250) sont ajoutés à 10 μL de la suspension cellulaire pour effectuer le comptage des cellules mononuclées en l'absence des globules rouges, qui sont lysés par cette solution après un temps d’incubation de 3 min à température ambiante (TA). Enfin les cellules sont ensemencées à 50 000 cellules mononuclées/cm² en flasks 75 cm² (Corning, Réf 430641), puis cultivées avec du milieu complet MEM à 37°C, 90 % d'humidité et 5 % CO2. Les CSM ont la propriété d'adhérer au plastique contrairement aux autres cellules de la moelle (telles que CSH) qui seront éliminées lors des changements de milieu. A ce stade les cellules sont à
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passage 0. L'entretien de la culture se fait deux fois par semaine avec du milieu complet
MEM. Expansion
Après 14 jours de culture les cellules sont trypsinées. Les cellules en flasks de 75 cm² sont rincées 2 fois avec 5 mL de PBS (GIBCO, réf 14190), puis, une solution de trypsine à 0,025% (GIBCO, Réf 25300-054) est ajoutée dans la boîte de culture et laissée au contact des cellules pendant 5 min à 37 °C, 90 % d'humidité et 5 % CO2. Pour inhiber l'action de l’enzyme, 5 mL de milieu complet MEM sont ajoutés. La suspension cellulaire est récupérée et centrifugée à 300 g pendant 10 min. Après avoir éliminé le surnageant, le culot cellulaire est repris dans 10 mL de milieu complet MEM et les cellules sont dénombrées (cf ci-dessous) avant d’être remis en culture à une densité de 1000 cellules/cm² dans des Flasks 75 cm² (Corning, Réf 430641U) à passage 1 et permettre l’amplification des cellules. Cette étape est renouvelée jusqu'au P5. A chaque passage, les analyses sont réalisées après 14 jours de culture.
Dénombrement
60 µL de suspension cellulaire sont mélangés à 20 µL de bleu trypan (SIGMA, Réf T8154). 20 µl sont déposés dans une cellule de Thoma. Le nombre de cellules comptées dans tout le quadrillage est multiplié par 10000 (car le volume du quadrillage est de 0,1 µL) et par le facteur de dilution afin d’obtenir le nombre de cellules/mL.
Congélation
Après trypsination, une partie du culot cellulaire peut être repris à 4 °C dans du milieu de congélation composé de SVF-DMSO 10 % (V/V) (Dymethyl Sulfoxid, FISHER BioReagents, Réf BP 231-1) à une densité d’au moins 1 million par tube. La suspension cellulaire est ensuite déposée dans un cryotube que l’on place dans une boîte de congélation « Coolcell » (PROTEIGENE, Réf BCS-136) pendant au moins 4 heures à -80°C permettant de descendre la température de 1 °C/minute. Les cryotubes sont ensuite conservés à -196 °C dans de l’azote liquide.
Décongélation
Pour remettre en culture les cellules conservées dans l’azote liquide, la suspension cellulaire est ramenée à 37°C en la mélangeant avec du milieu complet MEM à cette même température. Après centrifugation pendant 10 min à 300 g, le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet et les cellules sont ensemencées avec du milieu complet
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Clonogénicité
Les CSM sont ensemencées dans des boîtes rondes de culture de 60 cm² (Nunc, Réf 150350) à raison de 100 cellules/boîte pour la détermination des CFU (Colony Forming Unit) de P1 à P5. Le nombre de CFU est obtenu après coloration au cristal violet (SIGMA, Réf HT90132-1L) des boîtes rondes de culture. Pour cela, les cellules sont lavées 3 fois avec 5 mL de PBS (GIBCO, réf 14190) et incubées pendant 15 min avec 3 mL de cristal violet (SIGMA, Réf HT90132-1L) (violet de cristal 2.3% - oxalate d’ammonium 0.1% - éthanol 20%). Les cellules sont ensuite rincées avec de l’eau distillée et les boîtes sont numérisées grâce au scanner GS-800 (BIORAD). La taille et le nombre de CFU sont analysés grâce au logiciel ImageJ (National Institutes of Health, USA).
Calcul de la prolifération
Le « Population Doubling » (PD)
Le « population doubling » ou PD est déterminé pour les passages P1 à P5. Il correspond au nombre de fois où la cellule a doublé depuis son isolement et est calculé à partir de la formule suivante :
PD =log(Ni/Nx)/log2
Ni : le nombre de cellules initial
Nx : le nombre de cellules après trypsination
Le « doubling time » (DT)
Le « doubling time » ou le temps de doublement d’une population correspond au temps moyen dont a besoin cette population pour doubler son effectif. Il a été calculé selon la méthode de série temporelle en 2 point :
DT = t.ln(2)/(ln(Nx)/ln(Ni)
t : temps de culture
Ni : nombre de cellules initial
Nx : nombre de cellules après trypsination
Phénotypage par cytométrie en flux
Après avoir trypsiné et congelé les cellules à différents passages, celles-ci sont décongelées et lavées dans du PBS (GIBCO, réf 14190) pour ensuite être bloquées pendant 5 min à température ambiante (TA) dans du PBS-BSA 0,5 % (SIGMA-ALDRICH, Réf HT90132). Les cellules sont ensuite marquées avec des anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques couplés à la phycoérythrine (PE) ou au isothicyanate de fluorescéine (FITC) pendant 45 min à TA. La liste des anticorps utilisés dans ce travail est présentée dans l’annexe. Pour chaque
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échantillon des contrôles isotypiques sont réalisés en parallèle. Après un dernier lavage en PBS, 300 µL de PBS sont rajoutés et les cellules sont passées au cytomètre en flux (CMF) Gallios (BECKMAN COULTER).
Différenciation des CSM de MO
Culture
Après trypsination à P0 et P3, les CSM de MO sont ensemencées à P1 et P4 en plaques 24 puits (CORNING, Réf 3524) dans des milieux de culture spécifiques pour induire la différenciation ostéocytaire (O) (3100 cellules/cm²) (LONZA, Réf PT-3924) et adipocytaire (A) (21000 cellules/cm²) (LONZA, Réf PT-3102A et PT-3102B). Pour la différenciation chondrocytaire (C), les cellules seront ensemencées sous formes de pellets (150000 cellules/pellets) dans des tubes de culture de 15 mL (CORNING, Réf 430791) dans un milieu de culture spécifique (LONZA, Réf PT-3925) contenant le facteur de croissance Transforming
Growth Factor beta 3 (TGF-B3). Le détail de la procédure et des compositions des différents
milieux est décrit dans le protocole fourni par la société Lonza (cf annexe). Les cellules sont cultivées pendant 21 jours pour la différenciation A et O et pendant 28 jours pour la différenciation C avant de procéder à la mise en évidence de la différenciation par la coloration. Conformément à la procédure fournie avec les milieux de la société Lonza, les milieux de culture des cellules pour la différenciation O et C sont changés 2 fois par semaine. En revanche pour la différenciation A, 3 cycles induction (3 jours)/maintenance (1 à 3 jours) sont réalisés dès que les cellules cultivées dans l’MEM (Lonza, Réf BE12-169F) complet sont arrivées à confluence. Des contrôles négatifs sont réalisés en parallèle pour chaque différenciation : milieu complet MEM pour la différenciation O et C et milieu de maintenance pour la différenciation A.
Coloration
Coloration rouge alizarine
La coloration rouge alizarine permet de mettre en évidence les sels calciques en rouge, spécifiques des ostéocytes. Après avoir lavé 3 fois les puits par 1 mL de PBS (GIBCO, réf 14190), les cellules sont fixées pendant une 1 heure à 4 °C par de l’éthanol 70 % froid à raison de 0,5 mL par puits. Les puits sont ensuite lavés 3 fois par 1 mL d’eau distillée. La coloration s’effectue ensuite pendant 30 min à température ambiante après ajout de rouge alizarine 40 mM à raison de 0,5 mL par puits. Après avoir lavé 3 fois les puits par 1 mL d’eau distillée, la plaque est séchée à TA.
Les puits colorés sont ensuite photographiés au microscope inversé (Leica, DMI 3000B) à l’objectif X10 afin d’avoir une appréciation qualitative de la différenciation. Les images sont aussi analysées par le logiciel Image J (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, USA) afin de quantifier la différenciation.
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Un dosage après extraction du colorant rouge alizarine est réalisé afin d’estimer l’efficacité de la différenciation par une seconde méthode. Pour cela 0,5 mL par puits d’Hexadecylpyridinium chloride monohydrate (CPC) 10 % (V/V dans de l’eau) (SIGMA, Réf C9002-25G) est rajouté afin de dissoudre le colorant. 50 µL du surnageant sont ensuite prélevés et déposés dans une plaque 96 puits (GREINER BIO ONE, Réf 655101) afin de lire l’absorbance à 570 nm au spectrophotomètre (Varioskan Flash, THERMO SCIENTIFIC). Les puits différenciés sont comparés aux puits témoins non différenciés.
Coloration oil red
La coloration Oil red O permet de mettre en évidence les vésicules lipidiques en rouge spécifiques des adipocytes. Après avoir lavé 3 fois les puits par 1 mL de PBS (GIBCO, réf 14190), les cellules sont fixées pendant une heure à TA par formaldéhyde (VWR, Réf 20913.284) 10 % dilué dans du PBS à raison de 0,5 mL par puits. Les puits sont ensuite lavés 1 fois par 1 mL d’isopropanol 60% (CARLO ERBA, Réf 415213). La coloration s’effectue ensuite pendant 30 min à température ambiante après ajout de la solution de coloration à raison de 0,5 mL par puits. La solution de coloration est composée de 3 volumes d’oil red O (SIGMA, Réf O0625-25G) à 0,5 % (p/V) dans de l’isopropanol pur (CARLO ERBA, Réf 415213) pour 2 volumes d’eau distillée. Après avoir lavé 3 fois les puits par 1 mL d’eau distillée, la plaque est séchée à TA.
Les puits colorés sont ensuite photographiés au microscope inversé (Leica, DMI 3000B) à l’objectif X10 afin d’avoir une appréciation qualitative de la différenciation. Les images sont aussi analysées par le logiciel Image J (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, USA) afin de quantifier la différenciation.
Un dosage après extraction du colorant oil red est réalisé afin d’estimer l’efficacité de la différenciation. Pour cela 250 µL par puits de DMSO (FISHER BioReagents, Réf BP 231-1) sont rajoutés afin de dissoudre les vésicules lipidiques. 50 µL du surnageant sont ensuite prélevés et déposés dans une plaque 96 puits (GREINER BIO ONE, Réf 655101) afin de lire l’absorbance à 510 nm au spectrophotomètre (Varioskan Flash, THERMO SCIENTIFIC). Les puits différenciés sont comparés aux puits témoins non différenciés.
Coloration Bleu alcian/Kernechtrot
Le Bleu Alcian permet de mettre en évidence les mucopolysaccharides. A un pH acide (pH 1,3), il colore uniquement les polysaccharides sulfatés en bleu comme les GAG (sauf l'acide hyaluronique qui n'est pas sulfaté). Il met ainsi en évidence indirectement les protéoglycannes spécifiques de la matrice extracellulaire des chondrocytes. Pour visualiser plus précisément les cellules, le noyau est coloré en rouge avec une solution de Kernechtrot.
Les pellets sont fixés par de paraformaldéhyde 4% (PAF 4%) (Sigma, Réf P6148-500G ) pendant 24 heures au moins et sont ensuite placés entre deux rectangles de mousse (BIOPSY FOAM PADS, SIMPORT, Canada, réf. M476-1) dans des cassettes en plastique (SIMPORT, Réf
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M490-6). Les cassettes sont placées dans un appareil de déshydratation ASP 300S (LEICA, Allemagne) pour que les échantillons soient dans un premier temps déshydratés progressivement dans des bains croissant d'alcool : un bain d'alcool à 70° pendant une heure minimum, deux bains d'une heure d'alcool à 95°, et trois bains d'alcool absolu d'une heure. L'alcool est ensuite éliminé avec trois bains de toluène de 15 min. Enfin, les échantillons sont laissés dans un bain de paraffine liquide (+58°C) pendant 2-3 heures. Les prélèvements sont ensuite inclus définitivement dans la paraffine, puis les blocs se solidifient avec la diminution de la température.
Les blocs sont alors découpés après avoir été conservés à -20°C pendant au moins 24 heures de manière transversale en tranche d'une épaisseur de 5 μm, à l'aide d'un microtome (Leica, Réf RM 2135) et les coupes sont déposées sur des lames histologiques (Menzel-Gläser SUPERFROST®, Thermo Scientific, Réf LCSF02). Enfin les échantillons sont passés successivement dans différents bains d'alcool décroissants pour les réhydrater, puis sont colorés et déshydratés par un appareil de coloration comme décris succinctement dans le
Tableau 5 :.
Tableau 5 : Protocole de coloration Bleu Alcian
Bleu Alcian
Réactifs Temps (min)
Tissue Clear 10 Alcool 100° 5 Alcool 95° 5 Alcool 70° 5 Lavage 5 Bleu alcian 60 Bleu alcian 60 Lavage 5 Kernechtrot 5 Lavage 5 Alcool 95° 0,5 Alcool 100° 0,5 Tissue Clear 5 Total 171
Les échantillons seront colorés avec du Bleu Alcian (SEARLE DIAGNOSTIC, Réf M/N24) dilué à 0,1 %. à un pH de 1,3, solution de Kernechtrot (0,5 g de poudre de Kernechtrot (MERCK, 5189), 25 g de sulfate d'aluminium (PROLABO, Réf 21070297) dissous dans 500 mL d'eau distillée. Après la coloration, les lames histologiques sont montées sous lamelles avec une résine synthétique PERTEX (BALER, Réf 02407831) pour permettre l'observation des colorations avec un microscope optique (LEICA, DMD 108).
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L’analyse des images par le logiciel Image J (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, USA) permet de quantifier la coloration et donc d’estimer l’efficacité de la différenciation chondrocytaire.