Efectes del CCI

4.3.1.1 Canvis histològics produïts pel CCI

El model utilitzat en el nostre treball és un model de TBI focal, però també comporta dany cerebral en regions relativament allunyades de la cavitat de la lesió. El dany focal es produeix a conseqüència d’un impacte sobre la duramàter a nivell del lòbul parietal.

Això es tradueix en la mort cel·lular massiva en la zona de l’impacte i en la formació d’una cavitat, així com la deformació morfològica d’estructures adjacents, principalment l’hipocamp dorsal.

Tal com ja hem vist en treballs previs (Jacotte-Simancas et al., 2015; Amorós-Aguilar, et al., 2015), en aquest treball hem constatat que el CCI provoca una cavitat considerable

146

de lesió en el còrtex parietal de l’hemisferi ipsilateral, amb una profunditat màxima mitjana de 1.13 mm. A més, a l’hemisferi ipsilateral, dóna lloc a una reducció d’un 15.7% del volum global de l’hipocamp dorsal, i d’un 32.7% del volum de l’hilus del gir dentat, en comparació amb l’hemisferi contralateral. També produeix una pèrdua neuronal massiva a nivell de l’hilus (59.5%) i un increment de la reactivitat microglial a l’hipocamp dorsal (19.5%), amb presència de focus molt densos de micròglia activada, en comparació amb el grup sham. De fet, la totalitat dels animals del grup L-sed mostraven focus d’elevada densitat de cèl·lules Iba1+ de morfologia majoritàriament ameboide (micròglia activada). En molts casos, els focus incloïen també la presència de monòcits. Les anàlisis quantitatives indicaren un increment significatiu de la intensitat de gris, sense que hi hagués un augment significatiu de l’àrea amb marcatge. Això és coherent amb les observacions qualitatives, que ens mostraren que les àrees de reactivitat microglial no eren uniformes, sinó que la micròglia reactiva tendia a concentrar-se en regions específiques, envoltades per altres regions amb poca reactivitat.

D’acord amb l’anterior, tant la pèrdua neuronal i de volum de l’hilus, com la reactivitat microglial a l’hipocamp dorsal mostren un patró regional. Així, de les tres seccions analitzades, la més anterior (que, en la majoria d’animals es localitzava rostral a la cavitat de la lesió) mostrava només alteracions modestes. En canvi, les seccions ubicades en coordenades més posteriors, i coincidents amb part de la cavitat de la lesió, presentaven una afectació molt severa.

Finalment hem trobat que el nostre model de lesió redueix significativament la neurogènesi a la capa granular del gir dentat. Així, els animals lesionats sotmesos a una condició sedentària presentaven un menor número (45.8%) i densitat de cèl·lules DCX+

(34.9%) que el grup Sham en l’hemisferi ipsilateral a la lesió.

La reducció en el volum de l’hipocamp dorsal i l’hilus, i en el número de neurones madures en aquesta regió, observats 7 setmanes després de la lesió en el nostre experiment, ja eren presents a les 3 setmanes, tal com es va posar de manifest en un estudi previ en el nostre laboratori (Jacotte-Simancas et al, 2015). Ara bé, en aquest estudi previ també es va observar una certa disminució de neurones madures a la PRhc

147

de l’hemisferi ipsilateral, en comparació amb el contralateral. En canvi, en el present treball no hem trobat cap efecte del CCI sobre el número de neurones d’aquesta regió, força més allunyada del lloc d’impacte que l’hipocamp dorsal. Aquesta divergència entre els dos treballs podria ser deguda a petites diferències en la realització de la lesió. En aquest sentit, mentre que en el present experiment la coordenada anteroposterior mitjana d’inici de la cavitat de la lesió en el grup lesió sedentari era -2.83 respecte Bregma, en l’experiment de Jacotte-Simancas et al. (2015) era -1.9 respecte Bregma.

De manera concordant a les dades d’aquesta tesi, és un fet demostrat que el TBI, tant en models animals com en humans, provoca múltiples i complexos canvis inflamatoris que s’inicien poc després de la lesió i que es van modificant amb el temps. En general, el TBI a llarg termini produeix neuroinflamació crònica, pèrdua cel·lular i reducció de la neurogènesi en l’hemisferi ipsilateral a l’impacte (Glushakova et al., 2014; Acosta et al., 2013). L’increment de reactivitat microglial observat en aquest treball és congruent amb el que passa amb humans (Karve, Taylor i Crack, 2015) i també concorda amb les dades descrites en altres treballs amb el model CCI en rata i ratolí. Per exemple, Acosta i col.laboradors (Acosta et al., 2013) van trobar un increment de micròglia reactiva en diferents regions de substància blanca i grisa de l’hemisferi ipsilateral a la lesió, 8 setmanes després d’una lesió per CCI en rates. Tot i així, i a diferència del present treball, no es va trobar micròglia reactiva en el gir dentat de l’hipocamp. Aquest fet pot ser degut a dos motius. En primer lloc, la coordenada d’impacte respecte a Bregma en el treball d’Acosta et al. era força més anterior (+0.2 mm) que la del nostre treball (-4.5 mm). En segon lloc, el dany induït era menys sever (1 mm profunditat). Així mateix, Piao et al. (2013) també van trobar un increment del número de cèl·lules de micròglia reactiva 12 setmanes després d’un CCI en ratolins. En canvi, Turtzo et al., (2014) no van trobar neuroinflamació crònica (a les 8 setmanes post-TBI) en el còrtex circumdant a la lesió, en rates femelles amb una lesió per CCI més severa que la del nostre model (2.5 mm de profunditat). En concret, la reactivitat microglial associada a marcadors tant M1 com M2 ja havia tornat als nivells de les rates control a partir dels 5-7 dies post-TBI. Aquest fet pot ser degut a que només van analitzar àrees corticals circumdants a la cavitat de lesió, i a llarg termini podria ser que la reactivitat microglial es trobi en zones

148

pròximes però una mica més allunyades de la cavitat de lesió. De fet, Wang et al., (2013) seguien observant micròglia amb perfil M1 als 14 dies d’una lesió per CCI en ratolins en regions molt pròximes no circumdants a la cavitat de lesió, mentre que la micròglia amb perfil M2 havia tornat als nivells dels ratolins sham en aquest moment post-TBI.

Pel que fa la pèrdua cel·lular a l’hipocamp, els nostres resultats són concordants amb els d’altres treballs amb CCI, com el d’Acosta et al. (2013), que van trobar reducció del número de neurones madures en CA3, i el de Piao et al., (2013) que van observar una reducció en el gir dentat. En el nostre cas, la reducció s’ha estudiat en una altra regió de l’hipocamp, l’hilus. Pel que fa al número de neurones immadures, alguns treballs, tant del nostre (Jacotte-Simancas et al, 2015), com d’altres laboratoris (Acosta et al., 2013) no han trobat cap disminució en animals lesionats en comparació amb el sham, a diferència de les dades del present treball. Aquestes aparents discrepàncies podrien ser atribuïbles, entre altres factors, a diferències en la localització específica de la lesió i la seva severitat o al moment específic post-TBI en què s’analitza la neurogènesi.

4.3.1.2 Efectes sobre la memòria de reconeixement d’objectes

Els resultats del segon experiment han confirmat la persistència a llarg termini (53 dies) del dèficit en la MRO en animals sotmesos al mètode CCI per a la inducció de dany cerebral traumàtic quan el test de memòria té lloc 24 h després de l’adquisició.

En canvi, en el test de retenció a les 3 h, només s’ha trobat un efecte marginal de la lesió, doncs, si bé el grup amb lesió i condició sedentària no va mostrar un clar record de l’objecte familiar, el seu índex de discriminació no diferia del dels altres grups. En altres experiments realitzats en el nostre laboratori hem trobat resultats divergents en quant al test de retenció a les 3 h. Així, en l’Experiment 1 d’aquesta tesi no es va trobar efecte de la lesió, mentre que en altres treballs previs sí es va observar afectació (Jacotte-Simancas et al., 2015; Lorón-Sánchez et al., 2016). Tal com hem comentat en la discussió de l’Experiment 1, aquestes discrepàncies entre experiments, podrien ser degudes a petites diferències en l’aplicació de la lesió, o a les manipulacions concretes de cada disseny experimental. Tot indica que el record a les 3 h és més difícil d’afectar,

149

i això el fa molt sensible a petites variacions en la localització i extensió de la lesió. En canvi la retenció a les 24 h s’ha vist sistemàticament afectada en tots els treballs previs, la qual cosa indica que l’execució en aquesta prova és enormement vulnerable al model de TBI utilitzat. Els resultats tornen a suggerir que tant la demanda cognitiva com el substrat neural subjacent dels dos test de retenció, seguint la metodologia específica dels nostres experiments, són diferents. En primer lloc, en aquest segon experiment no s’ha trobat cap correlació entre els dos test de memòria. En referència a les bases neurals, en la formació de la MRO a les 3 h, tot i que hi participen diferents àrees, sembla que la PRhc té un rol clau (Barker et al., 2007; Warburton & Brown, 2015). Alguns autors consideren que la PRhc seria especialment crítica per a la consolidació de la memòria quan hi ha una alta ambigüitat entre les característiques visuals dels objectes, és a dir, quan aquests són molt similars entre ells. En concret, estaria relacionada amb la separació de patrons, és a dir, permetria emmagatzemar en diferents records memòries que per la seva similitud podrien quedar solapades (Miranda et al., 2017). Com en el nostre treball els objectes utilitzats durant les diferents sessions són molt diferents entre ells (forma i color), sembla que el paper de la PRhc en el nostre model de MRO estaria relacionat amb al reconeixement de la familiaritat de l’objecte, i no contribuiria a la consolidació de la memòria a llarg termini d’aquest reconeixement. Això concorda amb el fet que en el present experiment, en el que no s’ha observat dany en la PRhc, la MRO mesurada a les 3 h només està afectada marginalment, però en canvi sí que hi ha un dèficit clar d’aquesta memòria en els experiments en que aquesta regió cerebral mostra una disminució del número de neurones (Jacotte-Simancas et al., 2015). En canvi, en la MRO mesurada a les 24 h, tot i que la PRhc podria també intervenir, pel seu paper en el reconeixement visual dels objectes, l’hipocamp sembla intervenir de forma més important, degut al component espacial del segon test. El fet que l’hipocamp estigui molt relacionat amb el segon test, concorda tant amb el present experiment com amb els treballs previs, ja que en tots sempre hi ha una greu afectació tant de l’hipocamp, com del test de memòria a les 24 h. D’acord amb això, com hem indicat abans, els resultats actuals mostren una reducció important de teixit a l’hipocamp ipsilateral, especialment a la regió del gir dentat, una pèrdua neuronal a l’hilus, una disminució de la neurogènesis en l’hemisferi

150

ipsilateral, i un augment de la neuroinflamació, amb focus que s’observen en tots els animals.