Echantillons de cerveaux humains et de marmousets

Le but de cette étude était de tester différentes conditions de traitement d’échantillons

tissulaires en autoradiographie avec le radioligand [¹⁸F]-AV1451. Des autoradiographies ont

déjà été réalisées avec du tissu frais (Xia et al., 2013) et ont montrées qu’elle étaient co-localisées avec des IHC tau-PHF mais nous ne savons pas si nous pouvons utiliser d’autres types de tissu (notamment des tissus fixés par du formol ou ses dérivés). Nous avons testé en parallèle des échantillons de tissus cérébraux provenant de marmousets âgés. La Figure 70 correspond à un schéma récapitulant les différentes conditions utilisées pour les échantillons humains et pour ceux de marmousets. Nous espérons pouvoir trouver des conditions avec tissus fixés qui nous permettront d’analyser le plus d’échantillons possible car les échantillons de tissus frais de marmousets sont rares.

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 Humains

Ces échantillons témoins ont été mis à disposition par le Service universitaire d'Anatomie Pathologique Neuropathologie humaine et expérimentale du CHU de Toulouse et les différentes étapes de traitment des tissus ont été effectuées par ce service. Pour réaliser cette étude, des coupes de cerveau humain « témoin positif en AT8 » et des lames cerveaux humain « témoin négatif en AT8 » ont été choisies. Ces échantillons ont subi des traitements différents. Ci-dessous sont décrites brièvement les étapes de traitement des tissus :

Etapes du traitement des échantillons :

- Etape 1) Fixation : bain de formol 4% tamponné (24h) - Etape 2) Déshydratation :

La paraffine n'est pas miscible à l'eau, la pièce anatomique doit être entièrement déshydratée avant l'inclusion dans la paraffine. La paraffine n'est pas non plus soluble dans l'alcool utilisé pour la déshydratation. On remplace l'eau par de l'alcool (DÉSHYDRATATION). On remplace l'alcool par le xylène (SUBSTITUTION).

A) DÉSHYDRATATION par des bains l’alcool (5 min par bains) : Alcool 80°, Alcool 90°, Alcool Absolu.

B) SUBSTITUTION par des bains de xylène (5min par bain), le dernier étant un bain de xylène pur.

- Etape 3) Inclusion en paraffine : l'inclusion se fait dans des cassettes permettant la confection de blocs.

- Etape 4) Réalisation des coupes sur microtome (5 µm).

- Etape 5) Etalement de la coupe sur une lame puis collage et séchage.

- Etape 6) Déparaffinage.

o A ) Déparaffinage : bains de xylènes

o B ) Rehydratation : bains l’alcool puis d’eau (5 mn par bains) : Alcool

95°, Alcool 80°, Eau. - Etape 7) Démasquage :

162 La chaleur détruit certaines des liaisons formées entre le formol et les protéines antigéniques. Le démasquage a été réalisé par passage dans un milieu tamponné à chaud (bain-marie 95 °C, 15 min).

Nous avons utilisés des échantillons qui n’ont pas tous subi le même nombre d’étapes : - Tissu frais congelé (coupe de 8µm au crysotat)

- Paraffiné (aprés étape 5),

- Paraffiné et déparaffiné (après étape 6), - Démasqué (après étape 7)

 Marmousets

Des échantillons de deux marmousets âgés (10 ans et 9 ans) ont été testés. Il s’agissait de cerveaux prélevés après une perfusion de PFA 4% intra-cardiaque utilisée pour la conservation du tissu cérébral. Aucun cerveau frais de marmouset n’a été analysé. Les cerveaux n’ont pas été prélevés pour l’étude présente mais résultent de prélèvements effectués sur animaux âgés de la colonie du Centre de Recherche Cerveau et cognition (CERCO) euthanasiés dans le cadre d’autres protocoles. Les cerveaux prélevés ont été conservés dans une solution de cryoprotection à -20 °C.

Avant d’être utilisé chaque cerveau a été coupé en deux sur le plan sagittal puis l’hémi cerveau a été rincé par 3 bains de saccharose à 30 % dans du tampon phosphate, à température ambiante, avec agitation de la solution sucrée. Le bain a été changé toute les 12 h. L’hémi-cerveau a ensuite été coupé en 3 échantillons (frontal, hippocampique, occipital).

Ces 3 échantillons ont tout d’abord été coupés sur cryostat et mis sur lames (15 coupes de 8 µm d’épaisseur ont été réalisées sur chaque type d’échantillon). Pour chaque échantillon, il a été réalisé de l’immunohistochimie (AT8), de l’autoradiographie et un marquage à l’hématoxiline-éosine. (Ces échantillons correspondent à ceux appelés: « marmouset PFA »)

163 Les échantillons restant ont ensuite subit les étapes décrites dans la sous partie « humain ». Ces traitements ont été réalisés par le laboratoire d’anatomopathologie du CHU de Toulouse identiquement à ce qui avait été pratiqué pour les échantillons humains.

Les conditions

- Cerveau fixé PFA 4% , - Cerveau fixé PFA 4% +

o paraffiné sans autre traitement (après étape 5)

o paraffiné et déparaffiné avec du xylène (après étape 6)

o démasqué (après étape 7)

 Marquage AT8

Les coupes mises sur lames sont fixées 30 min avec de l’acétone froid à 4°C. Puis elles sont incubées dans du tampon phosphate 0.9% NaCl (PBS) toute une nuit pour réhydratation. Elles sont ensuite traitées avec du triton à 0.5 % et du sérum de chèvre à 5% dans du PBS pendant 1h sous agitation. Après une étape de lavage avec du PBS, la coupe est incubée 1h avec de l’AT8 à température ambiante (dilué au 1/500^ème dans du PBS). Aprés rinçage des lames au PBS, l’anticorps secondaire utilisé est couplé à une péroxydase (HRP), il est incubé pendant 30 minutes. Les coupes histologiques sont incubées avec le substrat de la peroxydase/chromogène 3,3’-diaminoben-zidine (DAB). La réaction à la peroxydase produit un précipité marron visible au niveau de l’antigène.

 IHC pour détection de la plaque amyloïde

Les échantillons marmousets se sont tous révélés négatifs pour la présence de plaques amyloïdes.

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 Autoradiographies

Les échantillons ont été maintenus à température ambiante pendant 1 h dans du TRIS à pH 7,4. Puis ils ont été incubés avec le radiotraceur : 1.85 MBq / mL (soit 18.5 MBq pour 10 mL) Cette concentration est 2 fois plus élevée que celle utilisée précedemment par Xia pour effectuer ses autoradiographies sur tissu frais humain présentant une MA (Xia et al., 2013). L’incubation a duré 1 heure. Elle a été suivie de 3 lavages de 5 min dans du TRIS pH = 7.4 puis d’un dessalage par trempage dans l’eau glacée 30 min et d’un séchage à l’O2. Les échantillons ont ensuite été mis en contact avec le Phosphorscreen pendant une nuit. Le phosphorscreen a été lu sur un Typhoon et les images recueillies en fichier d’extension « .gel. ». L’analyse des images a été réalisée avec le logiciel image J.

165 2.2. Résultats