R´ ealisation de fantˆ omes biologiques

D.1.1 Matrice

La matrice est le milieu exp´erimental simulant les tissus biologiques. Elle doit permettre l’insertion d’une h´et´erog´en´eit´e fluorescente simulant une pr´e-tumeur. Nous pouvons citer trois m´ethodes principales de matrices : les fantˆomes liquides, solides et souples. Les propri´et´es optiques des matrices peuvent ˆetre modifi´ees en ajoutant un certain volume d’encre ou de sang (pour leur propri´et´e absorbante) et d’intralipide ou de dioxide de titane (pour leur propri´et´e diffusante). Un spectrom`etre Lambda 19 (Perkin Elmer) permet ensuite de mesurer les propri´et´es optiques en fonction de la longueur d’onde.

Fantˆomes liquides

Les fantˆomes liquides sont compos´es de particules lipides en suspension et d’encre. L’´etude de la fluorescence homog`ene peut se faire en introduisant des sph`eres de poly-styr`ene d’un diam`etre de l’ordre du microm`etre [136]. Cependant, les fantˆomes liquides doivent ˆetre contenu dans un r´ecipient qui influence la mesure de par son indice de r´efraction. De plus, l’insertion d’objet n’est pas ´evidente. Nous avons donc choisi de proc´eder `a la comparaison d’une matrice solide et d’une matrice constitu´ee de gel.

Fantˆomes solides

Des fantˆomes solides permanents ont ´et´e r´ealis´es `a partir de r´esine `a base de styr`ene. Ce composant polym´erise sous l’action d’un catalyseur et se transforme en un mat´eriau tr`es dur en d´egageant de la chaleur (2% de solidifiant volume de r´esine). La pr´eparation doit se faire avec pr´ecaution afin d’´eviter les bulles et les d´eformations. Il est int´eressant d’anticiper la place des inclusions pour y introduire un autre m´elange de r´esine ou un m´elange liquide simulant les l´esions. Ces fantˆomes sont excellents pour la r´ep´etabilit´e des ´etudes et restent stables pendant des ann´ees. Les inconv´enients majeurs sont : la formation in´evitable de fissures, bulles ou autres asp´erit´es (voir Fi-gureD.1) et bien sˆur la trop grande rigidit´e du fantˆome par rapport aux tissus biologiques.

Fantˆomes souples

En raison des inconv´enients cit´es pr´ec´edemment, nous avons pr´ef´er´e r´ealiser les exp´eriences sur une matrice compos´ee de gel d’Agar (voir Figure D.2). Ce type de fantˆome est tr`es peu coˆuteux `a r´ealiser. De plus, il simule id´ealement les tissus biologiques par sa texture souple et par ses caract´eristiques optiques. En effet, le gel d’Agar est essentiellement constitu´e d’eau. Cependant quelques pr´ecautions sont `a prendre car le temps de vie de ce type de fantˆome est court (48 h au r´efrig´erateur) et il peut facilement ˆetre endommag´e `a la manipulation.

Annexes

Fig. D.1 – Fantˆome `a base de Styr`ene contenant une cible de vermiculite contrast´ee par de l’´eosine.

Fig. D.2 – Fantˆome de gel d’Agar.

D.1.2 Fluorophore

Nous souhaitons, pour les premi`eres exp´eriences, utiliser le fluorophore exog`ene de type ICG (Sigma Aldrich, I2633). Le vert d’indocyanine est le plus populaire et le plus accessible dans le commerce sous sa forme la plus pure. L’ICG est soluble dans l’eau mais `a cause des ph´enom`enes d’agr´egation et de quenching, l’intensit´e de fluorescence de l’ICG diminue consid´erablement au bout de 10 heures. Nous avons donc mis au point une technique pour ´eviter de r´ealiser un nouveau fantˆome toutes les 10 heures et pour ´eviter de perdre le pouvoir fluorescent de la mol´ecule. Cette m´ethode consiste `a faire un m´elange d’eau, d’ICG et de polyaspartate de sodium : cette solution aqueuse permet de stabiliser les interactions non covalentes de l’ICG et ainsi de pouvoir travailler avec le produit pendant plusieurs jours sans perdre les capacit´es de fluorescence [273].

Annexes

Le polyaspartate de sodium est pr´esent´e sous forme solide (PASP, Sigma Aldrich, P3418). Le protocole de pr´eparation est le suivant :

– diluer 100 mg de PASP dans 5 ml d’eau distill´ee. La concentration de PASP dans la solution est C₀ = 20 mg/ml d’eau.

– m´elanger 1 ml de la solution de PASP `a C0 + 1 ml d’eau distill´ee + 2 mg d’ICG. La solution obtenue est compos´ee de PASP `a 10 mg/ml et d’ICG `a 1 mg/ml avec donc un rapport de concentration de ICG/PASP= 0, 1.

Le jour de la fabrication de la solution ICG-PASP est d´esign´e par le jour 0. Le quatri`eme jour, l’ICG seul ne fluoresce plus tandis que la solution ICG-PASP g´en`ere un signal fluorescent jusqu’au 15eme` jour. Il peut ´egalement ˆetre int´eressant d’´etudier l’association de l’ICG `a des nanoparticules. En effet, des polym`eres nanoparticules peuvent porter l’ICG et le prot´eger de la d´egradation : ces nanoparticules sont des polym`eres poly-lactique glycolique acide (PLGA). L’article [274] montre que les nanoparticules polym´eriques assurent une stabilit´e aqueuse, thermique et une photo stabilit´e. De plus, le temps de vie de l’ICG augmente jusqu’`a 2,5 `a 3 jours.

D.1.3 Inclusion

Comme nous l’avons d´ej`a mentionn´e le fluorophore utilis´e est l’ICG qui est soluble dans l’eau. Par cons´equent il faut que notre inclusion soit capable de capter la solution dans laquelle l’ICG est dissout. De plus, cette solution ne doit pas ˆetre rejet´ee de l’inclusion, mˆeme apr`es plusieurs heures. L’ICG doit ´egalement ˆetre diffus´e de fa¸con homog`ene dans la cible. Nous avons test´e plusieurs types d’inclusions afin de choisir la plus appropri´ee pour les ´etudes futures. Le tableau D.1 r´esume tous les types de cible et leurs caract´eristiques.

Tab.D.1 – Comparaison des types d’inclusions.

Absorption Fixation Diffusion Forme

eau et colorant colorant homog`ene

Chlorure d’aluminium Oui Non Non Billes

Gel de silice Oui Oui Non Billes

Vermiculite Oui Oui Oui Al´eatoire

Pˆate `a modeler Oui Oui Non Adaptable

Annexes

L’´eosine ´etant un colorant soluble dans l’eau, nous l’avons utilis´e comme substitution `

a l’ICG afin d’effectuer les premiers tests. D’apr`es les r´esultats, les cibles les plus efficaces sont la vermiculite et les billes d’Albumine activ´ee. Toutefois, la forme des billes d’albumine (sph`eres dont le diam`etre varie de 1 `a 3 mm) est plus appropri´ee `a notre ´etude. De plus, leur capacit´e d’absorption est plus forte. Cette propri´et´e est essentielle afin de contenir efficacement le fluorophore en son sein lorsque l’inclusion est ins´er´ee dans la matrice de gel d’Agar.

D.1.4 Bilan

La premi`ere phase des travaux a permis de r´ealiser des fantˆomes biologiques et d’´evaluer leurs performances. Les ´etudes ont abouti aux conclusions suivantes : le fantˆome le plus adapt´e pour nos mesures exp´erimentales est constitu´e de gel d’Agar dans lequel est intro-duite une bille d’albumine contrast´ee par de l’Indocyanine Green (ICG). Ces premiers fantˆomes ont pu ˆetre ´etudi´es grˆace `a la mise en place d’un premier prototype (banc exp´erimental) fonctionnant dans le domaine continu avec un puissance-m`etre classique. Les diff´erentes mesures ont permis d’´etablir les premi`eres conclusions sur l’influence de la pro-fondeur d’une tumeur fluorescente ins´er´ee dans un milieu tissulaire. Les exp´erimentations ayant abouti aux conclusions mentionn´ees ci-dessus sont d´ecrites en d´etails dans [275].