R EACTION AVEC L ’ATTO 565

L’essai avec le marqueur ATTO 565 est réalisé sur une répétition à trois reprises de la mesure d’échantillon. Le graphique ci-dessous présente les moyennes et les intervalles de confiance.

Graphique 3.21 : réaction entre l’ATTO 565 (3.7 µM) et le lysozyme (24 µM) au ratio 1 :6 à pH 8.3

La valeur de ∆r s’élève à 0.09 et la vitesse de marquage est significative (tab. 3.1). L’intervalle de confiance est déterminé entre ± 0.01 et ± 0.04 selon les écarts-type et les moyennes de chaque mesure.

La déviation exprimée par les intervalles de confiance est plus importante sur l’appareil Setup Hes que sur celui du MD (cf. 3.1). Cette observation doit prendre en compte que le marqueur n’est pas le même et que les conditions sont différentes. Sur l’appareil MD, l’essai à deux répétitions, donc avec une valeur de t égale à 12.7, obtient une précision plus significative que l’essai à trois répétitions sur le Setup Hes avec un t de 4.3. Ce qui veut dire que le MD est plus précis que l’appareil Setup Hes. Le choix de l’ATTO 565 permet de discuter sur la sensibilité du laser par rapport à la LED. En effet, en comparant ce résultat avec ceux du FITC (cf. 3.8.1), il est intéressant d’observer qu’à ratio plus ou moins similaire, 1 :5 et 1 :6, et à des concentrations plus faibles, l’analyse au moyen du laser et avec l’ATTO 565 produit un plus important ∆r. Le laser augmente la sensibilité du signal par rapport à la source LED.

0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 a n is o tr o p ie [ -] temps [min] moyenne sur 3 mesures blanc: ATTO + tampon à pH 8.3

39

4. C

L’interprétation de l’anisotropie d’une réaction entre un marqueur et une protéine demande un certain recul, afin de considérer tous les facteurs influençant le résultat. Cette méthode d’analyse est non sélective concernant la nature de la molécule. Par contre, elle est adaptée pour suivre la cinétique de réaction et le changement de taille d’une molécule. A l’état actuel, il n’est pas possible de connaître le nombre de marqueurs ayant réagi avec la lysine. La méthode ne permet pas de garantir la réaction des six lysines par lysozyme. L’anisotropie visualisée peut être le résultat de différents phénomènes comme la réaction ciblée, l’intervention de produits secondaires, l’agglomération de protéine ou l’hydrolyse du marqueur. Il est difficle de pouvoir quantifier chaque interaction sur la fluorescence polarisée.

Cependant ce travail a permis d’observer et de qualifier différentes influences externes et conditions de réactions. Premièrement, l’excès de protéine avec des concentrations en réactifs supérieures à celle en OH^- favorise le marquage au détriment de l’hydrolyse. Un pH de travail inférieur à 9 réduit la concentration en OH^- et l’influence de l’eau sur les marqueurs. Le milieu doit être, malgré tout, assez basique, afin d’augmenter la nucléophilie de l’amine primaire de la lysine. La disponibilité de la protéine peut être optimisée en affaiblissant l’agglomération des molécules. La polarité et la viscosité du solvant ont un impact important sur l’intensité fluorescente et l’anisotropie de la molécule. La présence de protéines dans la solution pourrait influencer le degré d’hydrolyse des marqueurs.

La fluorescence polarisée est intéressante pour l’étude de la cinétique de réaction. Cette propriété est, finalement, un facteur prépondérant dans la recherche perpétuelle de méthode fonctionnant toujours plus rapidement, mais avec précision et robustesse. La sélection d’un marqueur pouvant réagir rapidement et de façon répétée doit être accompagnée de plusieurs observations. L’expérience a démontré, malgré les perturbations citées, que le CFSE était un bon choix de marqueur lors de l’utilisation de la source LED. Sans que tous les phénomènes et les influences externes soient maîtrisés, il n’est pas possible de confirmer l’exclusivité de la cinétique au marquage de la protéine.

Dans les futurs travaux, un effort pourrait être entrepris pour répondre à différentes questions. Est-ce que l’hydrolyse possède le même impact sur le marqueur sans et avec la protéine dans la solution ? Quelles sont les différences significatives de l’hydrolyse en modifiant les concentrations et le pH ? Quelles sont les conséquences directes sur l’anisotropie lors de l’ajout d’un surfactant ? Est-ce qu’il est possible, en optimisant la méthode, de la rendre sélective afin de déterminer une configuration de protéine ? Comment peut-on optimiser le choix des matériaux afin d’éviter la perte de réactifs ou la diminution d’intensité ? L’emploi du laser n’est-il pas plus intéressant par rapport à la sensibilité du rayon ? Pourrait-on travailler à des concentrations proches de la limite de détection de la fluorescence sans être péjoré par l’hydrolyse ? Peut-on protéger chimiquement le marqueur de l’hydrolyse ? Voilà bien des questions prouvant de la capacité de cette méthode à développer un outil performant pour le marquage à des fins médicales ou scientifiques.

5. R

Ce travail a été réalisé avec le soutien scientifique, la disponibilité et les conseils du Professeur Jean-Manuel Segura et de Monsieur Julien Héritier. Un remerciement particulier est exprimé envers Madame Géraldine Delasoie-Crittin pour sa patience et son soutien.

6. B

[1] Biological Magnetic Resonance Data Bank: lysozyme

http://www.bmrb.wisc.edu/featuredSys/Lysozyme/lysozyme1.html (06.08.2012)

[2] Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R., Sequencial purification of lactoferrin, lysozyme and secretory immunoglobulin A from human milk, Elsevier Biomedical Press, p.1, (1982)

[3] Revenis M., Kaliner M., Lactoferrin and lysozyme deficiency in airway secretions: Association with the development of bronchopulmonary dysplasia, The Journal of Pediatrics, vol 121, p. 262, (1992)

[4] Laibe S. et al., Augmentation des synthèses locales de la lactoferrine et du lysozyme chez des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine avec candidose oropharyngée : rôle de l’immunité muqueuse innée ?, Journal de Mycologie médicale, vol. 15, p. 70 et 72, (2005)

[5] A Short History of Fluorescence, The Fluorescence Foundation

http://www.fluorescence-foundation.org/lectures/madrid2010/lecture1.pdf (06.08.2012)

[6] Atkins P., De Paula J., Chimie physique, De Boeck (2008, 8^ème éd.)

[7] Université de Leipzig : Introduction-Fluorescence Microscopy

http://www.uni-leipzig.de/~pwm/web/?section=introduction&page=fluorescence (31.07.2012)

[8] Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/ Plenum Publishers (1999, 2^ème éd.)

[9] Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie, CNRS (2009)

http://www.ifr87.cnrs-gif.fr/pbc/formation/pdf2009/BROWN_FluorochromesCHAPITRE.pdf (06.08.2012)

[10] Principe physique de la fluorescence,

http://www.snv.jussieu.fr/~wboudier/ens/cours/cours-mec-fluorescence.pdf (06.08.2012)

[11] Lau S. et al., Nanomolar derivatizations with 5-carboxyfluorescein succinimidyl ester for fluorescence detection in capillary electrophoresis, Journal of Chromatography A, 809, 205-208 (1998)

[12] Segura J.-M-, Techniques de fluorescence avancées : Applications en bioanalytique, HES-SO Valais, 26-27 (2011)

41 [14] Amresco : 0663 lysozyme, egg white

http://www.amresco-inc.com/LYSOZYME-EGG-WHITE-0663.cmsx (06.08.2012)

[15] Price W. et al., Time Dependence of Aggregation in Crystallizing Lysosyme Solutions Probed Using NMR Self-Diffusion Measurements, Biophysical Journal, 80, 1585 (2001)

[16] Bernath F., Vieth W., Lysozyme activity in the presence of nonionic detergent micelles, John Wiley & Sons (1972), 737

[17] Vollhardt P, Schore N., Traité de chimie organique,De Boeck (2009, 5^ème éd.)

[18] Université de Prague : Fluorescence Polarization

www.jh-inst.cas.cz/~fluorescence/.../UFCH_fluorence_polarization (13.08.2012)

[19] Time-Resolved Fluorescence Anisotropy

http://web1.johnshopkins.edu/csl/academics/ionchannels/CourseNotes/coursenotes2011 /Vogel_Anisotropy.pdf (06.08.2012)

[20] Fiche technique : Instructions NHS-fluorescein n°46406-46410, Thermo scientific (2011)

[21] Weber G., Polarization of the fluorescence of solutions dans Fluorescence and Phosphorescence Analysis, John Wiley et Sons (1966, 3^ème éd.), p. 217 à 240

7. A

A Protocole de réglage et de mise en route de l’appareil Setup Hes

B Vue d’ensemble des concentrations, des ratios et des pH pour chaque essai

C Vue d’ensemble des anisotropies, des t_1/2 et des constantes de vitesse pour chaque essai

D Valeurs des anisotropies pour la détermination du facteur Z

43

Annexe A : Protocole de réglage et de mise en route de l’appareil Setup Hes

1. Fermer le shutter et enclencher la source lumineuse, les robots des polarisateurs et le détecteur;

Image A.1 : interrupteurs principaux des sources lumineuses, des robots des polarisateurs et du détecteur 2. Installer l’objectif 40x ;

3. Installer le support pour un échantillon et ajuster la position de l’objectif à l’axe du support;

4. Placer le miroir pour la réflexion totale avec la face dorée face à l’objectif ; 5. Régler la caissette en position 4 correspondant à la transmittance totale ;

6. Régler la focale en obtenant la meilleure netteté à l’aide des jumelles et de la lampe supérieure du microscope ;

Image A.2 : vue d’ensemble de l’appareil Setup Hes avec le support de microplaque

7. Tourner la manette frontale afin de diriger le rayon vers le détecteur et lever le miroir réflecteur en mode FP;

Image A.3 : vue aérienne du compartiment des polarisateurs de sortie et du détecteur

8. Selon le choix de la source lumineuse, abaisser la loupe et la source LED pour le laser ou lever la lampe pour le mode LED en amont du microscope;

Image A.4 : vue d’ensemble des sources lumineuses, des filtres OD et du polarisateur d’entrée 9. Installer le carton et le drap noir sur le compartiment du détecteur, éteindre la lumière de

la salle fermer la porte à clé et brancher le câble au détecteur ;

10. Ouvrir le shutter et contrôler avec un papier blanc l’absence de lumière intense aux jumelles;

11. Régler les OD pour le laser ou l’intensité de la LED de façon à obtenir un signal dans le domaine de mesure du détecteur ;

12. Régler le polarisateur parallèle à son intensité maximale et le polarisateur perpendiculaire à son intensité minimale ;

13. Fermer le shutter et régler la caissette sur la position n°1 pour le laser ou sur la position n°3 pour la LED ;

14. Tourner la manette frontale afin de diriger le rayon vers les jumelles; 15. Désinstaller le miroir, fixer le support avec la microplaque;

16. Transférer 200 µl d’une solution du marqueur à concentration élevée (200 µM) dans le port échantillon ;

17. Placer l’objectif à l’axe du puits concerné, ouvrir le shutter, contrôler l’intensité lumineuse aux jumelles et baisser l’objectif au maximum ;

18. Régler la netteté en surface inférieur du liquide et immerger la focale dans l’échantillon en tournant la manette de l’objectif vers soi de 30°;

19. Tourner la manette frontale afin de diriger le rayon vers le détecteur

20. Régler les OD pour le laser ou l’intensité de la LED de façon à obtenir un signal dans le domaine de mesure du détecteur ;

21. Vérifier les intensités maximale et minimale des polarisateurs et si besoin, ajuster à la main les angles des polarisateurs ;

22. Fermer le shutter

Contrôler aux jumelles l’absence totale de réflexion du rayon dans la paume de

la main ou à l’aide d’un papier !

Vérifier l’absence de métaux comme des bagues pouvant réfléchir le rayon du laser !

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Annexe B : Vue d’ensemble des concentrations, des ratios et des pH pour chaque essai

Graphique Appareil Répétition Marqueur Protéine Ratio ^c marqueurinit.

[µM]

c _{protéine init.}

[µM] ^{c marqueur [µM] c protéine [µM] pH [-] c OH- [µM]} 3.1 MD 2 CFSE lys ozym e 1:5 35 175 17.5 87.5 8.3 2.0

MD 1 CFSE blanc 35 17.5 8.3 2.0

3.2 MD 1 FITC blanc 27 13.5 7.4 0.3

MD 1 FITC blanc 27 13.5 9.1 12.6

MD 1 FITC blanc 27 13.5 11.3 1995.3

3.3 MD 1 FITC lys ozym e 1:10 27 204 13.5 102 7.4 0.3 MD 1 FITC lys ozym e 1:10 27 208 13.5 104 9.1 12.6 MD 1 FITC lys ozym e 1:10 27 207 13.5 103.5 11.3 1995.3 3.4 MD 1 CFSE lys ozym e 1:2 170 372 85 186 8.3 2.0

MD 1 CFSE lys ozym e 1:2 170 372 85 186 8.3 2.0 MD 1 CFSE lys ozym e 1:2 170 372 85 186 8.3 2.0 MD 1 CFSE lys ozym e 1:2 170 372 85 186 8.3 2.0 MD 1 CFSE lys ozym e 1:2 170 372 85 186 8.3 2.0 MD 1 CFSE lys ozym e 1:2 170 372 85 186 8.3 2.0 3.6 MD 1 CFSE lys ozym e 1:10 3.4 34 1.7 17 8.3 2.0 MD 1 FITC lys ozym e 1:10 3.4 34 1.7 17 9.1 12.6

MD 1 CFSE blanc 3.4 1.7 8.3 2.0

MD 1 FITC blanc 3.4 1.7 9.1 12.6

3.7 et 3.21 Setup Hes 3 ATTO lys ozym e 1:6 7.4 48 3.7 24 8.3 2.0

Setup Hes 1 ATTO blanc 7.4 3.7 8.3 2.0

3.8 MD 2 FITC lys ozym e 1:8 27 208 13.5 104 7.4 0.3 MD 2 FITC lys ozym e 1:1 27 20.8 13.5 10.4 7.4 0.3 MD 2 FITC lys ozym e 8:1 27 3.4 13.5 1.7 7.4 0.3 MD 2 FITC lys ozym e 8:1 136 20.8 68 10.4 7.4 0.3 MD 2 FITC lys ozym e 1:1 136 104 68 52 7.4 0.3 3.9 et 3.11 MD 2 FITC lys ozym e 1:8 27 208 13.5 104 9.1 12.6 MD 2 FITC lys ozym e 1:1 27 20.8 13.5 10.4 9.1 12.6 MD 2 FITC lys ozym e 8:1 27 3.4 13.5 1.7 9.1 12.6 MD 2 FITC lys ozym e 8:1 136 20.8 68 10.4 9.1 12.6 MD 2 FITC lys ozym e 1:1 136 104 68 52 9.1 12.6 3.10 MD 2 CFSE lys ozym e 1:11 34 387 17 193.5 8.3 2.0 MD 2 CFSE lys ozym e 1:1 340 387 170 193.5 8.3 2.0 MD 2 CFSE lys ozym e 1:11 3.4 38.7 1.7 19.35 8.3 2.0 MD 2 CFSE lys ozym e 1:1 34 38.7 17 19.35 8.3 2.0 MD 2 CFSE lys ozym e 9:1 340 38.7 170 19.35 8.3 2.0

MD 2 CFSE blanc 340 170 8.3 2.0

3.14 MD 1 CFSE lys ozym e 1:10 34 340 17 170 8.3 2.0 MD 1 CFSE lys + tween 1:10 34 340 17 170 8.3 2.0

MD 1 CFSE blanc 34 17 8.3 2.0

3.15 MD 1 FITC lys ozym e 1:10 34 340 17 170 9.1 12.6 MD 1 FITC lys + tween 1:10 34 340 17 170 9.1 12.6

MD 1 FITC blanc 34 17 9.1 12.6

3.16 MD 1 CFSE lys ozym e 1:10 17 175 8.5 87.5 8.3 2.0 MD 1 CFSE cytochrom e 1:10 17 178 8.5 89 8.3 2.0

MD 1 CFSE blanc 17 8.5 8.3 2.0

3.17 MD 1 FITC lys ozym e blanc 17 88 8.5 44 9.1 12.6 MD 1 FITC cytochrom e blanc 17 89 8.5 44.5 9.1 12.6

MD 1 FITC blanc 17 8.5 9.1 12.6

3.20 Setup Hes 1 FITC lys ozym e 1:10 24 240 12 120 9.1 12.6 Setup Hes 1 FITC lys ozym e 1:5 24 120 12 60 9.1 12.6 Setup Hes 1 FITC lys ozym e 1:1 24 24 12 12 9.1 12.6

Annexe C : Vue d’ensemble des anisotropies, des t1/2 et des constantes de vitesse pour chaque essai

Graphique Appareil Répétition Marqueur Protéine Ratio r 0 [-] r max [-] ∆ r [-] r 1/2 [-]

3.1 MD 2 CFSE lysozyme 1:5 0.138 0.303 0.165 0.221 MD 1 CFSE blanc 0.138 0.148 0.010 0.143 3.2 MD 1 FITC blanc 0.115 0.119 0.004 0.117 MD 1 FITC blanc 0.115 0.153 0.038 0.134 MD 1 FITC blanc 0.115 0.226 0.111 0.171 3.3 MD 1 FITC lysozyme 1:10 0.115 0.285 0.170 0.200 MD 1 FITC lysozyme 1:10 0.115 0.290 0.175 0.203 MD 1 FITC lysozyme 1:10 0.115 0.279 0.164 0.197 3.4 MD 1 CFSE lysozyme 1:2 0.135 0.305 0.170 0.220 MD 1 CFSE lysozyme 1:2 0.134 0.176 0.042 0.155 MD 1 CFSE lysozyme 1:2 0.134 0.163 0.029 0.149 MD 1 CFSE lysozyme 1:2 0.130 0.150 0.020 0.140 MD 1 CFSE lysozyme 1:2 0.130 0.147 0.017 0.139 MD 1 CFSE lysozyme 1:2 0.118 0.135 0.017 0.127 3.6 MD 1 CFSE lysozyme 1:10 0.151 0.234 0.083 0.193 MD 1 FITC lysozyme 1:10 0.125 0.240 0.115 0.183 MD 1 CFSE blanc 0.151 0.155 0.004 0.153 MD 1 FITC blanc 0.125 0.130 0.005 0.128

3.7 et 3.21 Setup Hes 3 ATTO lysozyme 1:6 0.116 0.208 0.092 0.162

Setup Hes 1 ATTO blanc 0.116 0.119 0.003 0.118

4.8 MD 2 FITC lysozyme 1:8 0.105 0.299 0.194 0.202 MD 2 FITC lysozyme 1:1 0.105 0.210 0.105 0.158 MD 2 FITC lysozyme 8:1 0.105 0.149 0.044 0.127 MD 2 FITC lysozyme 8:1 0.105 0.149 0.044 0.127 MD 2 FITC lysozyme 1:1 0.105 0.241 0.136 0.173 3.9 et 3.11 MD 2 FITC lysozyme 1:8 0.105 0.297 0.192 0.201 MD 2 FITC lysozyme 1:1 0.105 0.267 0.162 0.186 MD 2 FITC lysozyme 8:1 0.105 0.200 0.095 0.153 MD 2 FITC lysozyme 8:1 0.105 0.200 0.095 0.153 MD 2 FITC lysozyme 1:1 0.105 0.252 0.147 0.179 3.10 MD 2 CFSE lysozyme 1:11 0.129 0.304 0.175 0.217 MD 2 CFSE lysozyme 1:1 0.129 0.264 0.135 0.197 MD 2 CFSE lysozyme 1:11 0.129 0.228 0.099 0.179 MD 2 CFSE lysozyme 1:1 0.129 0.240 0.111 0.185 MD 2 CFSE lysozyme 9:1 0.129 0.159 0.030 0.144 MD 2 CFSE blanc 0.129 0.129 0.000 0.129 3.14 MD 1 CFSE lysozyme 1:10 0.126 0.292 0.166 0.209

MD 1 CFSE lys + tween 1:10 0.126 0.231 0.105 0.179

MD 1 CFSE blanc 0.126 0.131 0.005 0.129

3.15 MD 1 FITC lysozyme 1:10 0.114 0.270 0.156 0.192

MD 1 FITC lys + tween 1:10 0.114 0.225 0.111 0.170

MD 1 FITC blanc 0.114 0.122 0.008 0.118

3.16 MD 1 CFSE lysozyme 1:10 0.145 0.286 0.141 0.216

MD 1 CFSE cytochrome 1:10 0.145 0.172 0.027 0.159

MD 1 CFSE blanc 0.145 0.145 0.000 0.145

3.17 MD 1 FITC lysozyme blanc 0.128 0.210 0.082 0.169

MD 1 FITC cytochrome blanc 0.128 0.155 0.027 0.142

MD 1 FITC blanc 0.128 0.137 0.009 0.133

3.20 Setup Hes 1 FITC lysozyme 1:10 0.080 0.124 0.044 0.102

Setup Hes 1 FITC lysozyme 1:5 0.080 0.123 0.043 0.102

47

Annexe D : Valeurs des anisotropies pour la détermination du facteur Z

Réaction CFSE + tampon ^{Réaction CFSE + tampon +}

lysozyme

N° puits t_{0 min} t_{50 min} N° puits t_{0 min} t_{50 min}

1 0.107 0.104 19 0.125 0.137 2 0.108 0.103 20 0.122 0.138 3 0.109 0.103 21 0.121 0.137 4 0.107 0.103 22 0.124 0.138 5 0.105 0.104 23 0.122 0.138 6 0.106 0.103 24 0.119 0.134 7 0.106 0.104 25 0.123 0.138 8 0.107 0.104 26 0.124 0.137 9 0.105 0.103 27 0.122 0.136 10 0.105 0.102 28 0.124 0.137 11 0.106 0.103 29 0.12 0.137 12 0.105 0.104 30 0.116 0.133 13 0.106 0.103 31 0.125 0.136 14 0.105 0.104 32 0.119 0.136 15 0.107 0.103 33 0.117 0.134 16 0.106 0.102 34 0.122 0.137 17 0.106 0.104 35 0.116 0.135 18 0.104 0.102 36 0.116 0.133