Chapitre VII Etude de robustesse : domaine d’application
VII. E.2.b Basse teneur en modificateur organique
Le Tableau VII-6 regroupe les résultats obtenus pour les coefficients normalisés des facteurs de rétention des composés hydrophiles, élués à basse teneur en modificateur organique. Tableau VII-6 : Estimations des coefficients normalisés pour la modélisation des facteurs de rétention au niveau bas de solvant ; seuls les coefficients significatifs sont figurés.
Strychnine d-Tubocurarine Atropine Ampicilline
Solvant MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN
Moyenne 5,01 5,17 6,48 14,10 4,54 5,18 3,04 1,22 %S -4,79 -8,69 -8,76 -13,92 -4,54 -8,49 -4,43 -10,02 T -2,14 -2,33 -2,87 -2,97 -1,76 -1,65 -1,59 -0,49 pH 6,86 6,42 13,37 12,26 5,59 5,85 2,23 3,22 Conc. 0,89 0,84 1,19 1,02 %S*%S 0,86 T*T pH*pH Conc.*Conc. %S*T %S*pH -0,55 %S*Conc. T*pH T*Conc. pH*Conc. -1,57 R2 1,00 1,00 0,99 0,99 1,00 1,00 0,99 1,00 Q2 0,89 0,88 0,68 0,57 0,85 0,88 0,79 0,79
Cyanocobalamine Vancomycine Caféine Benzylamine
Solvant MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN MeOH MeCN
Moyenne 4,89 3,05 1,83 0,98 3,61 2,51 0,75 0,63 %S -9,17 -18,06 -9,36 -18,25 -4,41 -7,43 -2,14 -4,48 T -3,30 -2,54 -2,91 -1,99 -1,93 -1,79 -1,13 -1,46 pH 4,74 5,62 6,18 6,83 Conc. 1,42 1,26 %S*%S T*T pH*pH Conc.*Conc. %S*T %S*pH %S*Conc. T*pH T*Conc. pH*Conc. 0,55 R2 0,99 1,00 1,00 1,00 0,99 1,00 0,99 0,99 Q2 0,68 0,85 0,78 0,81 0,72 0,80 0,84 0,70
Deux facteurs sont systématiquement mis en évidence : il s’agit de la teneur en modificateur organique et de la température.
Encore une fois, les qualités d’ajustement et de prédiction atteignent des valeurs élevées. La cyanocobalamine et la caféine se comportent comme des solutés neutres, puisque leur facteur de rétention ne dépend que de la teneur en modificateur organique et de la température. Pour la caféine, les coefficients sont comparables à ceux observés pour les composés hydrophobes dans le méthanol. Cependant, le coefficient de la teneur en solvant relatif à la cyanocobalamine s’avère deux fois plus important en comparaison avec les valeurs obtenues à haut niveau de solvant. Pour comprendre ce phénomène, qui s’accentue encore dans l’acétonitrile, il est nécessaire de prendre en compte tous les composés, y compris ceux dépendants du pH. Comme on constate des résultats similaires pour la vancomycine et que ces deux composés possèdent une masse moléculaire élevée, il nous paraît intéressant d’étudier une possible relation entre la masse moléculaire du composé et l’effet relatif de la teneur en solvant correspondant, représentée en Figure VII-4.
A la fois pour l’acétonitrile et le méthanol (non figuré), on note une dépendance en fonction de la masse des composés, mais uniquement pour les composés de nature hydrophile. Cette relation est deux fois plus intense dans le solvant non protique. L’existence même de cette dépendance semble prouver que les mécanismes mis en jeu à basse teneur en solvant diffèrent de ceux qui gouvernent la rétention à haut niveau de modificateur organique.
A faible niveau de solvant, la phase stationnaire est certainement moins bien solvatée par la phase mobile : le volume de phase se retrouve plus réduit, et l’état global, plus ramassé, sans qu’elle soit effondrée. En outre, l’élévation de la masse moléculaire entraînant aussi une augmentation du rayon apparent du soluté, elle affecte tous les paramètres qui régissent la rétention suivant la théorie solvophobe : la formation de la cavité, les interactions soluté-éluant ainsi que la surface de contact [365]. L’interaction hydrophobe s’exprimant d’autant plus que la phase mobile est riche en eau, il apparaît plus logique de la mettre en évidence à ce niveau de solvant plutôt qu’au précédent. Comme la théorie solvophobe englobe les mécanismes de partage et d’adsorption [366], il nous semble qu’à basse teneur en solvant, la rétention est plutôt régie par des phénomènes surfaciques, donc plutôt gouvernée par adsorption, tandis qu’à haut niveau de modificateur organique est privilégié un mécanisme de partage, par définition de nature volumique, autorisant le phénomène de pénétration des solutés dans la phase stationnaire.
-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Masse moléculaire % S ( c oe ff ic ie nt n o rm a li s é )
Figure VII-4 : Graphique du coefficient normalisé de la teneur en solvant en fonction de la masse moléculaire du solutés en acétonitrile ; composés hydrophiles ; z composés basiques hydrophobes ; ■ composés neutres hydrophobes.
Pour tous les composés autres que la caféine et la cyanocobalamine, le pH s’avère être logiquement aussi un facteur influent de première catégorie. L’influence relative des facteurs principaux dépend de la nature du modificateur organique. Dans le méthanol, l’ordre d’influence constaté est pH>%S>T>Conc. tandis qu’en acétonitrile, on observe une inversion des deux premiers facteurs : %S>pH>T>Conc.. Cette fois-ci, la teneur en solvant semble plus affecter les solutés hydrophiles ionisables que leur homologues hydrophobes et le pH se révèle moins influent qu’auparavant. Ainsi, la présence d’un terme quadratique n’est plus nécessaire pour assurer une bonne modélisation : puisqu’à basse teneur en solvant, les constantes d’acidité se rapprochent de celles observées dans l’eau, un modèle linéaire suffit, les zones de pH et de pKa ne
se recouvrant plus. Cependant, il est intéressant de relever l’inversion de l’effet de la concentration entre la basse et la haute teneur en solvant, lorsqu’il est révélé significatif. Autant à haut niveau de solvant, ce facteur traduisait la participation d’un mécanisme d’échange de cations à la rétention des composés basiques, autant à basse teneur en modificateur organique, cela ne semble pas être le cas. Les solutés basiques considérés sont très majoritairement sous forme ionisée aux niveaux de teneur considérés. En outre, la concentration en acétate de la phase mobile avoisine celle de la phase tamponnée purement aqueuse. Dès lors, il est possible d’envisager un mécanisme d’appariement d’ion entre les ions acétate CH3COO- et les bases BH+,
selon la théorie de des ions structurants/déstructurants46 [367-372] : la formation d’un complexe
ionique entre l’acétate et la base ionisée produit un ensemble globalement neutre, par conséquent plus retenu par interactions apolaires avec la phase stationnaire que chaque sous-ensemble chargé. Cette contribution à la rétention dépend de l’accessibilité du groupement basique, donc de la conformation de la molécule basique chargée. Sur la d-tubocurarine, ce phénomène n’est pas mis en évidence, vraisemblablement pour cause de manque d’accessibilité des groupements basiques. Dans le cas contraire, la concentration en acétate, toujours largement supérieure à celle du soluté47, se révélerait par un coefficient plus élevé que celui des composés monocationiques.
L’absence de ce phénomène pour la d-tubocurarine est en outre confirmée par l’influence du facteur pH, deux fois plus importante que pour les autres composés basiques. En effet, le pH ne possède qu’une influence minime sur la rétention des complexes.
46 Cette théorie est connue sous le vocable anglo-saxon de « chaotropicity » 47 Condition sine qua non à la formation de ces complexes ioniques
Concernant les asymétries de pics de l’atropine et de la benzylamine, la qualité d’ajustement du modèle est beaucoup trop réduite pour permettre une quelconque discussion sur l’influence des facteurs mis en évidence. Quant aux efficacités, on trouve par ordre d’influence le pH suivi de la concentration du tampon.