La méthode de suivi du développement Mac utilisée en routine dans l’équipe consistait à observer le grossissement des ébauches au microscope sur des cellules fixées et colorées au DAPI (Dubois et al. 2017). Les ébauches sont classées en trois classes : précoces -intermédiaires - tardives, définies par l’avancement du cycle sexuel et par la taille moyenne des nouveaux Mac. En effet, les réplications massives du génome et donc, l’accroissement de la taille des ébauches, sont concomitantes avec les RPG.
Afin d’étayer l’ensemble des phénotypes associés à une ARNi KU, l’analyse en Im-munoFluorescence (IF) de Pgm est un outil puissant. Cependant, la localisation nucléaire des protéines des RPG est dynamique. Pgm-GFP était décrite comme nucléaire dans des ébauches précoces mais absente dans les tardives (Dubois et al.2017). Ces catégorisations sont suffisantes pour des effets forts et très contrastés, mais manquent de précision pour les effets plus subtils, néanmoins tout aussi intéressants, d’où la nécessité de développer des méthodes de quantification de la taille des ébauches et du signal d’IF L’autogamie peut être déclenchée sur de larges populations par carence alimentaire. En conditions optimales, la synchronie de la population autogame est d’environ 6 heures, c’est à dire que la première cellule à avoir déclenché le processus peut avoir6heures d’avance sur la
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dernière. Cela produit donc une population hétérogène. Ainsi, il est possible d’avoir en IF, dans une même population, des cellules marquées ou non par Pgm dans les ébauches.
Cette hétérogénéité empêche donc une comparaison fine des intensités de fluorescence entre différentes conditions.
Afin de contourner ce problème, nous avons cherché à vérifier s’il était possible de lier précisément la taille des ébauches présentant un marquage Pgm à l’état d’avancement des RPG. Ainsi, nous pourrions comparer l’effet en IF de différentes conditions d’ARNi en comparant des ébauches de tailles identiques.
Des expériences sur des cellules en conjugaison ont été réalisées par Nathalie Mathy (AI CNRS dans l’équipe). La conjugaison présente l’avantage sur l’autogamie d’être beau-coup plus synchrone. Cependant, elle ne permet pas de travailler facilement sur de larges population car elle implique généralement un tri manuel de chaque cellule. Afin d’avoir des données plus précises sur l’évolution de la taille des ébauches au cours des RPG, des cellules en conjugaison ont été fixées à différents temps, de 8 à20 heures après le début de la conjugaison et la taille des ébauches a été mesurée grâce à un module d’analyse écrit par Romain Le Bars de la plateforme d’imagerie de l’I2BC (détails en matériels et méthodes) (Figure IV.1).
Cette expérience montre qu’une ébauche a une taille comprise entre 30et75µm² lors de l’excision des IES. Il était ensuite important de vérifier si Pgm était localisée dans les ébauches correspondant à ces tailles en utilisant l’anticorps α-Pgm (Figure IV.2). La dynamique de la localisation nucléaire de Pgm correspond aux tailles d’ébauches lors de l’excision des IES (30-75µm²). En autogamie, la localisation nucléaire de Pgm a été décrite comme organisée en foci, sur un fond nucléoplasmique granuleux par Dubois et al. (2017), observation reproduite ici plus finement grâce à l’utilisation de cellules en conjugaison, fournissant une plus grande synchronie.
Note technique Le protocole de fixation utilisé dans les figures IV.1et IV.2est un proto-cole optimisé pour la détection du Pgm nucléaire (Dubois et al.2017). Il inclut une étape de perméabilisation par du Triton (détergent) antérieure à la fixation des cellules. Ce pro-tocole, en plus de permettre une observation optimale de Pgm, provoque l’extraction des
IV.1. Localisation de Pgm 73
FigureIV.1–Taille des ébauches en conjugaison en fonction de l’avancement du cycle sexuel
Représentation en boîtes à moustaches des tailles d’ébauches en fonction du temps en heure depuis le début de la conjugaison, observées au microscope. Les fixations ont été réalisées en condition de pré-extraction. La taille de l’échantillon pour chaque boîte à moustache est représentée par la valeur n. Le moment correspondant à l’excision des IES, représenté en gris, a été déterminé par Gratias and Bétermier (2001). Le moment du début et de la fin des réarrangement n’est pas encore défini très précisément, d’où la représentation en gradient. Expérience de Nathalie Mathy.
FigureIV.2–Dynamique de la localisation nucléaire de Pgm en conjugaison en fonction de l’avancement du cycle sexuel
Imagerie confocale en un plan d’IFα-Pgm sur des cellules en conjugaison après un traitement de pré-extraction. Les ébauches sont entourées de pointillés jaunes et ont été triées par taille en µm².
Les noyaux marqués au DAPI mais non marqués par Pgm sont les fragments de l’ancien Mac.
Expérience réalisée conjointement avec Nathalie Mathy.
protéines labiles (Martini et al.1998) et met donc en évidence les protéines solidement accrochées à une structure, ici le noyau et donc probablement la chromatine.
Un protocole sans pré-perméabilisation et donc sans pré-extraction a également été utilisé dans différentes expériences de ce manuscrit et dans Bischerour et al. (2018). Il permet de mettre en évidence l’ensemble des protéines, labiles ou non. La comparaison des résultats obtenus entre les protocoles avec ou sans pré-extraction permet donc de conclure sur la force d’association de la protéine étudiée avec le noyau.
Pgm est fortement associée aux ébauches excisant les IES Ces deux premières expé-riences nous permettent de dire qu’un marquage nucléaire de Pgm en protocole de pré-extraction correspond à des ébauches de 35 à 68 µm² de section (Figure IV.2) qui est la gamme de taille des ébauches pendant la fenêtre de temps où se produit l’excision des IES (Figure IV.1). Dans les expériences suivantes, les ébauches présentant un marquage Pgm en condition contrôle définissent la gamme de tailles d’ébauches utilisée pour compa-rer les intensités de fluorescence dans des conditions d’ARNi différentes. Cette méthode d’analyse a été développée conjointement avec Vinciane Régnier.
IV.1.2 Effet de l’extinction de Ku sur la localisation de Pgm