A modificação de moléculas tem se tornado amplamente estudada no intuito de compreender como os grupamentos químicos podem modificar as atividades farmacológicas e a estrutura destas moléculas (Li et al., 2016).
Existe uma forte preocupação com o uso de técnicas de modificação que não causem muitos prejuízos ao meio ambiente, ou seja, que utilizem poucos ou nenhum reagentes nocivos à natureza sendo, portanto, estas técnicas de modificação química denominadas de "química verde".
A química verde emergiu de uma série de ideias existentes e de esforços para se fazer pesquisas no período que precedeu a década de 1990, no contexto de dar atenção aos problemas da poluição química e do esgotamento de recursos. O desenvolvimento da química verde na Europa e nos Estados Unidos foi ligado a uma mudança nas estratégias para resolver problemas ambientais através de novos métodos (VACCARO, 2016).
A síntese verde concentra-se na utilização de materiais de baixo custo, eficazes, biocompatíveis, que causam poucos danos ao meio ambiente e com um menor número de passos de execução para obter o do produto final. A síntese “completamente verde” é tida como um avanço a mais na síntese verde, pois nesse caso utiliza-se apenas água, como solvente, e extratos aquosos de vegetais e moléculas extraídas de fontes naturais, como no caso de algas, como redutores e/ou estabilizantes (RAVEENDRAN; FU; WALLEN, 2003).
A seguir se descrevem técnicas tidas como amigáveis ao meio ambiente e que foram utilizadas aqui nesta tese.
1.3.1. Sulfatação por ácido sulfurico
A sulfatação de polissacarídeos é um processo no qual o produto da reação são polissacarídeos contendo grupamentos sulfato (SO4). Porém, para que esta reação ocorra é necessário a inserção de trióxido de enxofre (SO3) a um oxigênio que fazia parte do grupamento hidroxila do polissacarídeo (ou hidroxila de outra molécula). É importante salientar que esta ligação carbono-oxigênio-enxofre é o que define a sulfatação (FOSTER, 1997) (Figura 3).
Figura 3- Reação de sulfatação de acordo com Foster (1997). Reação que ocorre
pela inserção de trióxido de enxofre (SO3) a um oxigênio que fazia parte de outra molécula.
Fonte: Figura adaptada de Foster, (1997).
Grande parte dos métodos de sulfatação utiliza de ácido sulfúrico como fornecedor de grupos sulfato e propanol como agente estabilizante da reação. Vale salientar que estes métodos normalmente não sulfatam todas as posições de todos os monossacarídeos do polissacarídeo, isso porque de acordo com Möller et al. (2012) a posição em que uma hidroxila é substituída por sulfato esta relacionada com as posições das ligações glicosídicas (pois estas posições não vão estar disponíveis para a sulfatação) e também com as posições das primeiras sulfatações (pois vão dificultar a sulfatação de posições adjacentes à região já sulfatada).
A sulfatação comumente aumenta a atividade antioxidante de polissacarídeos, como já foi observado nos trabalhos de Ma et al. (2017) e Barahona et al. (2011) e diversos outros trabalhos como mostra a tabela 2. Porém, alguns compostos são menos susceptíveis a sulfatação que outros, consequentemente a técnica não é efetiva para todos.
Tabela 2- Trabalhos que identificaram atividade antioxidante potencializada por
processos de sulfatação.
Polissacarídeo e/ou fonte:
Teor de sulfato (%) ou grau de substituição
(GS)
Referência
Lentinan de Lentinus edodes 1,45 e 1,57 GS Feng et al. 2010 Artemisia sphaerocephala 0,51 – 1,24 GS Wang et al, 2014
Porphyra haitanensis Auricularia auricular 2,48-39,2 % 0,90 e 0,78 GS Zhang et al, 2010 Zhang et al, 2011 Artemisia sphaerocephala 7,62-11,58 % Wang et al. 2010 Tricholoma lobayense 1,22 GS Xuehui et al, 2016
Pleurotus eryngii 2,9-12,5 % Jung et al. 2011 Adenanthera pavonina, C. férrea e D.
gardneriana
0,72-0,82 GS Marques et al, 2015
Quitosana 9,55-12,54 % Zhong et al. 2007
Enterobacter cloacae 1,88-9,4% Jin et al. 2011 Galactomananas de goma 0,89 – 1,42 GS Wang et al. 2012
Dictyophora indusiata Cyclocarya paliurus Tricholoma lobayense 0,58-1,55 GS 0,24-6,82% 13,6 % Deng et al. 2015 Xie et al. 2014 Li et al. 2016 Ulva pertusa Seda de milho Sphallerocarpus Cordyceps gunnii Ganoderma atrum Ganoderma atrum Phoma herbarum 30,8 e 32,8% 0,17-1,35 GS 0,42 – 1,01 GS 0,33 GS 0,65 - 3,43 GS 0,35; 0,74 e 1,14 GS 1,01 e 1,36 GS Qi et al. 2005 Chen et al. 2013 Xu et al. 2016 Zhu et al. 2013 Chen et al. 2015 Zhang et al. 2015 Yang, Gao & Tan 2005
Grau de substituição – GS. Fonte: Autoria própria.
Em contrapartida, a inserção de grupos diferentes do grupo sulfato pode significar uma maior chance de modificar a molécula como também potencializar sua atividade. Este é o caso da técnica de modificação de polissacarídeos por descarga de barreira dielétrica (DBD).
1.3.2. Modificação por plasma de barreira dielétrica
O DBD é uma técnica na qual se utiliza o plasma como agente modificador da amostra trabalhada. O plasma é um gás parcialmente ionizado contendo partículas
carregadas (elétrons e íons), radiação, térmica, luz visível, radiação ultravioleta, campo eletromagnético e radicais (Alves Jr, 2001).
Os principais tipos de plasma são o de baixa pressão e o atmosférico. O plasma de baixa pressão é aquele em que é inserido sobre um material em uma estrutura a vácuo. Pela necessidade do vácuo e a formação de calor durante o processo, esta técnica se torna inviabilizada quando se utiliza uma grande quantidade de material ou materiais sensíveis a temperatura como tecidos e polímeros (ALVES JR, 2001).
Por outro lado, a utilização de plasma atmosférico ocorre sem a formação de grande calor, técnica também conhecida como plasma a frio (Cold atmospheric
plasma). Nesta técnica, o gás é fracamente ionizado sob as condições atmosféricas
abaixo de 40 oC.
O aparato usado para geração da DBD consiste em uma fonte de voltagem controlada por um ociloscópio, este, responsável por medir e analisar a diferença de potencial (DDP) em função do tempo, existente no sistema. Para a formação do plasma é utilizado um gás que é inserido no tubo em contato com o dielétrico (que está acoplado à fonte de energia e ao osciloscópio). O dielétrico tem função de isolar o sistema e também espalha o plasma, distribuindo-o por toda a superfície da amostra. Vale salientar que o plasma formado é estável e uniforme (figura 4).
Durante o processo de formação do plasma ocorre a ruptura do gás, que está entre os eletrodos do equipamento, por meio de microdescargas rápidas que se distribuem pelo dielétrico (KOGELSCHATZ, 2002). Uma fração de átomos e moléculas gasosas colidem com elétrons e isso resulta em mais excitação, ionização e dissociação enquanto o plasma continua frio (KLÄMPFL, 2012). Neste processo é formado um plasma homogêneo, não equilibrado, cujos principais grupos químicos observados são: H, NO, CN, O3, e os radicais: H, O, N e N2+ (MACHALA et al., 2007). Quando as espécies reativas atingem a superfície do substrato, novos grupos funcionais podem ser formados com a quebra da cadeia da molécula, substituições e recombinações de átomos podem ocorrer promovendo modificações da superfície do material (JORDÁ-VILAPLANA et al., 2014).
Figura 4- Esquema de um equipamento de descarga de barreira dielétrica (DBD). 1-
ociloscópio, 2- fonte de energia, 3- dielétrico, 4- Gás hélio. Azul= Amostra; Rosa= Plasma; Verde= Material dielétrico; Preto= Eletrodos.
Fonte: Autoria própria.
De acordo com Manakhov et al. (2015) o tratamento de polímeros com plasma atmosférico tem a capacidade de produzir uma variedade de espécies quimicamente ativas o que lhe conferem grupos químicos (incluindo grupos carboxílicos, aminas e hidroxílicos) que podem modificar suas propriedades e atividades. Esta técnica é menos tóxica que as modificações químicas e modificam somente a superfície dos polímeros. Além disso, Jorda-Vilaplana et al. (2014) apontam que tratamentos químicos podem gerar desperdícios que podem ser danosos ao meio ambiente como por exemplo a carbonização química (Chopra et al., 2006)
Abaixo (tabela 3), expõem-se com mais detalhes, atividades de polissacarídeos modificados com DBD relacionadas com os resultados obtidos nessa dissertação.
Entre os diferentes grupos reativos depositados pela pressão atmosférica em técnicas de DBD Manakhov et al. (2015) e Hody et al. (2010) destacam que a inserção de grupos carboxílicos (COOH) são os mais amplamente usados para aplicações biotecnológicas graças a sua reatividade e estabilidade no ar.
Tabela 3- Atividades de polissacarídeos modificados com Descarda de barreira
dielétrica (DBD).
Atividade Referência
Aumento da polaridade Pankaj et al. (2015) Aumento da gelificação Molina et al. (2014)
Adesiva Ren, et al. (2017)
Antimicrobiano Macêdo et al. (2013)
Antimicrobiano Nawalakhe et al. (2013) Aumento da adesão celular Silva et al. (2008)
Aumento da polaridade Theapsak et al. (2012) Aumento da polaridade Dorraki et al. (2015)
Aumento da adesão celular
Girard-Lauriault et al. (2009)/ Zeniieh et
al. (2013)/ Guex et al. (2014)/ Lee et al.
(2008)
Inserção de ácidos carboxílico Jorda-Vilaplana et al. (2014) Fonte: Autoria própria.
Além disso, é relatado na literatura que o aumento no conteúdo de grupos carboxílicos podem resultar em aumento de atividades farmacológicas (YANG & DU, 2003). Tendo em vista as grandes vantagens de se modificar materiais por caboxilação por DBD, esta técnica foi utilizada para se identificar possíveis alterações nas atividades antioxidantes.
Não há relatos na literatura sobre melhoria na atividade antioxidante de moléculas modificadas por meio da técnica de DBD. Pois isso neste trabalho também se realizou modificação química por inserção de uma molécula já conhecida por sua potente ação antioxidante, o ácido gálico.
1.3.3. Ácido gálico e sua conjugação com moléculas
De acordo com Badhani, Sharma & Kakkar, (2015) o ácido gálico (ácido 3,4,5- tri-idroxibenzóico) é um composto fenólico natural que consiste em um anel aromático, três grupos hidroxila e um ácido carboxílico, sua estrutura é planar e de baixo peso molecular. Ele é comumente extraído de plantas e possui alto poder
antioxidante além de já serem relatadas (por Badhani, Sharma & Kakkar, (2015) também atividades: anticâncer, anti-inflamatório, antimicrobiano, antimelanogênico, antiviral, antialérgico, neuroprotetivo e hepatoprotetivo. Os mesmo autores relataram que o ácido gálico é um protetor eficiente contra danos oxidativo causados por espécies reativas normalmente encontradas em sistemas biológicos como: radical hidroxila, radical superóxido, peroxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Tendo em vista este grande efeito o ácido gálico já é amplamente utilizado como fármaco, cosmético, alimento, na confecção de embalagens de alimentos e na indústria como antiaderente e anticorrosivo (Badhani, Sharma & Kakkar, 2015).
Por outro lado, é conhecido também por autores como Strlic et al. (2002) que o ácido gálico pode exibir tanto atividades antioxidantes como também pro-oxidantes, caracterizando um comportamento dual. Badhani, Sharma & Kakkar, (2015) propuseram que a atividade antioxidante do ácido gálico esta relacionada à estabilidade dos grupos hidroxil. A adição de radicais nos grupos hidroxil podem então ter influência na atividade antioxidante deste composto. Adicionalmente Galato
et al. (2001) mostraram que quando grupos hidroxil do anel aromático são
substituídos a atividade antioxidante do ácido gálico aumenta.
Outros trabalhos tém se detido a investigar a estabilidade da molécula quando modificadas em diferentes posições. A saber, os anéis aromáticos possuem denominações próprias para posições, sendo elas: orto, meta e para, indicadas na figura 5.
Figura 5 - Representação da estrutura do ácido gálico. Anel aromático indicado no
centro, grupo carboxila circulado em vermelho, grupos hidroxila circulados em azul e posições do anel aromático denominados em verde.
Fonte: Adaptado de Queiroz, 2019.
Por exemplo, estudos de Galato et al. (2001) relatam que a presença de um grupo doador em uma posição para (como um novo composto inserido, no caso metil) e a retirada de um elétron na posição orto estabiliza a molécula, sendo possível compreender então porque a inserção de um radical em uma das três hidroxilas promove a tendência do ácido gálico doar seu elétron, aumentando sua atividade antioxidante no teste de sequestro de radical DPPH. Derivados de ácido gálico já foram relatados também para atividades: de sequestro de radical peroxil, azida, e hidroperoxil
O ácido gálico, apesar de forte antioxidante, pode ter sua atividade potencializada por meio de conjugação com outras moléculas. A conjugação já foi realizada em estudo de Curcio, et al. (2009) em que realizou-se uma de conjugação de ácido gálico por um procedimento de criação de radicais. Este procedimento se baseia no uso de H2O2/ácido ascórbico para formar uma região redox que envolve a oxidação do ácido ascórbico pelo H2O2 em temperatura ambiente (KITAGAWA, et
al., 2006). Posteriormente em um único passo um radical pode ser adicionado (como
um polissacarídeo) ao ácido gálico (figura 6). Os autores relatam que o uso deste sistema redox permite a geração de um polissacarídeo funcional, com alto
rendimento e sem a necessidade de mão de obra especializada ou geração de compostos tóxicos, sendo, portanto, um processo que não agride o meio ambiente.
A incorporação do ácido gálico em quitosana forneceu um conjugado com alto poder antioxidante (92% de inibição do radical DPPH e 60% de quelação do radical hidroxil). A capacidade antioxidante da quitosana por outro lado, era considerada baixa (14% e 17% para as mesmas atividades, respectivamente).
Figura 6- Esquema de um possível mecanismo de inserção de ácido gálico em
polissacarídeos. Na imagem mostra-se a inserção em dextrana. Os radicais hidroxila, gerados pela interação entre os componentes do par redox, ataca os átomos-H em R-metileno (CH2) ou grupos hidroxila (OH) do hidroximetileno do polissacarídeo. AA = ácido gálico.
Fonte: Figura adaptada de Queiroz (2019).
A quitosana por outro lado, é uma fonte de polissacarídeos de fonte animal. Uma grande desvantagem de se utilizar polissacarídeos animais como fontes de compostos antioxidantes com aplicação para os seres humanos está na proximidade filogenética entre ao humanos os demais animais. Consequentemente contaminantes alérgenos e/ou patogênicos como príons, vírus e proteínas podem
desencadear diversos distúrbios. Por outro lado, polissacarídeos de algas não oferecem esse risco devido a distância evolutiva entre seres humanos e algas, tornando-se então uma fonte confiável de obtenção de polissacarídeos (Jiao, et al., 2011).
Até o momento, no entanto, nenhum polissacarídeo neutro de alga teve sua estrutura modificada de modo a potencializar a atividade antioxidante. Por outro lado, polissacarídeos sulfatados já tiveram suas atividades antioxidantes descritas e não tiveram suas atividades antitumoral, antibacteriana e imunomodulatória investigadas.
1.3.4. Síntese de nanopartículas 1.3.4.1. Nanopartículas metálicas
Comumente nanopartículas são descritas como material ou propriedade que ocorre em dimensões de escala nanométrica entre 1 e 100 nm (DREADEN et al., 2012). Porém, outros autores estipulam um tamanho diferente para a definição de nanopartículas; Satyavani et al, (2011) se referem a partículas com tamanho maior que 100 nm e menor que 1 µm. Para esta tese, utilizar-se-á a definição abordada por Satyavani.
As nanopartículas metálicas possuem características singulares em relação a outros tipos de nanopartículas. As nanopartículas metálicas, por exemplo, possuem menor tamanho e maior superfície de reatividade, o que permite a interação com outras moléculas (PARVEEN; MISRA; SAHOO, 2012). A aplicabilidade das nanopartículas incluem diversas áreas da indústria como a aeroespacial, química, eletrônica, energética, cosmetológica (STARK et al., 2015), alimentícia, ambiental, biomédica, dentre outras (MULLER; SHEGOKAR; KECK, 2011).
As nanopartículas podem ser compostas por diversos metais como ouro, cobre, estrôncio, zinco, ou prata (CHO et al., 2008; PARVEEN; MISRA; SAHOO, 2012). Um dos tipos de nanopartícula metálica sintetizada por processos verdes que vem sendo utilizado com polissacarídeos é a nanopartícula de prata (NEGREIROS 2015).
1.3.4.2. Nanopartículas de prata
A prata, desde os primórdios, vem chamando a atenção por suas diversas aplicações na área médica como no caso do tratamento de queimaduras (CASTELLANO et al., 2007) e de algumas infecções de pele ou tecido subcutâneo, como abscessos perianais (KLASEN, 2000). Em escala nanométrica, a prata tem gerado interesse de pesquisadores de diferentes áreas desde o início da era da nanotecnologia. A prata é moldável e maleável, possui elevada condutividade térmica e elétrica, além de ser um oxidante forte. Nanopartículas de prata apresentam aplicações promissoras em diversos campos da ciência e tecnologia (RAI et al., 2015).
As nanopartículas de prata são agregados de átomos de prata que variam de diâmetro e apresentam diferenças em relação às propriedades da prata metálica. Estas possuem propriedades farmacológicas importantes. Alguns exemplos são a atividade antifúngica contra o Cladosporium cladosporoides, o Aspergillus niger e também contra a Candida albicans (KIM et al., 2009). Além disso, apresenta ainda as atividades anti-inflamatória (YILMA et al., 2013), citotóxica contra células tumorais (GURUNATHAN et al., 2013; KASSAS; ATTIA, 2014) e antiangiogênica (BAHARARA et al., 2014).
Diante das propriedades que as nanopartículas de prata apresentam e visando utilizá-las na terapêutica é interessante entender o processo de síntese, como no caso do processo de síntese em fase líquida ou coloidal que apresentam reações químicas em solventes conduzindo à formação de coloides.
Uma das fontes de substâncias que podem ser utilizadas na síntese verde de nanopartículas de prata são os polissacarídeos de fontes naturais (YOUSEFZADIA
et al., 2014). Muitas são as atividades relatadas na literatura de nanopartículas de
prata com polissacarídeos (VIANA 2017). 1.4. Fonte de obtenção dos polissacarídeos 1.4.1. Alga Lobophora variegata
L. variegata é amplamente distribuída pelo mundo como nas regiões do: Caribe,
Oceano Índico, Mar Vermelho (KREMB et al., 2014), Austrália, Mediterrâneo, e litoral brasileiro (MEDEIROS et al., 2008). Essa alga pode crescer a profundidades de até
25 metros (STEVENINCK; BREEMAN, 1987) e é encontrada principalmente em ambientes tropicais (TAYLOR 1960). A L. variegata apresenta elevada habilidade de adaptação e importância ecológica quando analisada como indicadora de contaminação ambiental e de herbivorismo além de ser elementar na biota marinha para várias espécies de peixes e crustáceos (COEN; TANNER, 1989).
Vários estudos demonstram o potencial uso de L. variegata como organismo de alto valor ecológico, nutricional e farmacológico (RODRIGUES et al., 2009), inclusive dos seus polissacarídeos (MEDEIROS et al., 2008).
1.4.2. Alga Dictyota mertensii
A alga D. mertensii foi descrita em 1859 por Kützing Friedrich, esta é uma macroalga bentônica de ocorrência restrita à região tropical do Brasil (FREITAS, NUNES & PAULA, 2007). Ela possui características típicas do seu gênero como cor marrom-amarelada ou marrom-esverdeada, fixas ao substrato por numerosos rizóides, apresentando talo achatado, parenquimatoso, em forma de fita, às vezes torcido em espiral, sem nervura, ramificado dicotomicamente e folíolos com margens lisas ou denteadas (FREITAS, NUNES & PAULA, 2007).
D. mertensii sintetiza diferentes polissacarídeos que já são pesquisados quanto
ao potencial biológico, como por exemplo: atividade anticoagulante (MARQUES et
al., 2019); antiviral (QUEIROZ et al.,2008); antioxidante e capaz de inibir células
cancerígenas (COSTA et al., 2010).
Desse modo, pode-se observar que estes organismos marinhos (L. variegata e
D. mertensii), são importantes fontes de polissacarídeos bioativos.
Diante do exposto, e tendo em mente que o litoral potiguar, assim como o nordestino, detém várias espécies de algas marinhas que não tiveram seus polissacarídeos neutros e sulfatados estudados completamente, este trabalho teve como objetivo realizar uma prospecção das principais modificações químicas em polissacarídeos neutros (laminarinas) da alga Lobophora variegata e polisscarídeos sulfatados (fucanas) da alga Dicytiota mertensii e verificar as suas atividades antioxidantes in vitro, escolhendo as melhores modificações para caracterização estrutural.
2 OBJETIVO GERAL
Extrair polissacarídeos das algas Lobophora variegata e Dictyota mertensii, modificá-los quimicamente por diferentes técnicas e identificar algumas de suas atividades farmacológicas.