3. 3.2 Dosage des protéines

Une méthode colorimétrique est utilisée pour effectuer ce dosage. Elle est développée par Lowry et al, (1951) qui ont combiné une réaction au biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, réagit avec les tyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute à celle du biuret. La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa principale qualité. Elle peut atteindre 5-10 µg. La zone de linéarité de la réaction est cependant étroite et il faut utiliser la portion linéaire de la courbe qui correspond à l'absorption de la sérum albumine bovine (SAB).

Mode opératoire

Dans un tube à essai 1 ml de l’extrait et ajouté à 5ml de réactif de Lowry. Après agitation, 0.5 ml de Folin Ciocalteu dilué extemporanément au 1/2 est ajouté au mélange (une agitation est nécessaire après l’ajout du Folin).

La droite d’étalonnage a été préparée à partir de sérum albumine bovine (5g/l) à différentes concentrations suivant les mêmes étapes de notre échantillon.

Réactif de Lowry:

50 ml de solution de Lowry A est additionnée à 1 ml de solution de Lowry B.

Solution de Lowry A: Na2CO3 1 g NaOH (0.1 mol.L^-1) 50 ml Solution de Lowry B: CuSO4 5H2O 25 mg Tartrate de K et Na 50 mg H2O 5 ml

V.3.4. Teneur en matière grasse

En utilisant l’extracteur de SOXHLET le jujube est pesé et placé dans une capsule. L’échantillon est extrait en continu par de l’éther de pétrole à l’ébullition qui dissout graduellement la matière grasse (Penchev, 2010). . Le solvant contenant la matière grasse retourne dans le ballon par déversements successifs causés par un effet de siphon dans le coude latéral du dispositif de distillation. Comme seul le solvant peut s’évaporer de nouveau, la matière grasse s’accumule dans le ballon jusqu’à ce que l’extraction soit complète.

Une fois l’extraction terminée l’éther est évaporé par Rotavapor et la MG est pesée.

I.3.5. Dosage des sucres totaux

Les sucres sont dosés par une méthode spectrophotométrique de Dubois et

al,(1956) . Les glucides en milieu acide sulfurique et à chaud sont déshydratés en dérivés du furfural qui se combine facilement avec le phénol et donnent une coloration jaune (le glucose fournit de l’hydroxyfurfural). La coloration est permanente.

Cette méthode est très sensible puisqu’elle permet de détecter des quantités de glucides de l’ordre de 1µg.

Mode opératoire

La solution à doser (1ml de l’extrait hydrique du fruit de jujube) est mise dans un tube à essai avec 1 ml de phénol à 5% dans l'eau. 5 ml de H2S04 sont ajoutés rapidement sans les faire couler le long des parois et le mélange est agité immédiatement. Une coloration jaune se développe, stable durant plusieurs heures. Les tubes sont placés au bain-marie à 25°C pendant 15 minutes puis refroidis sous eau à 20°C.

L'absorbance est mesurée à 492 nm.

Les teneurs sont déterminées en référence à une gamme étalon de glucose.

V.3.6. Détermination de la teneur en acide ascorbique

La quantification de la vitamine C (acide ascorbique) est réalisée par la méthode de 2,6 dichlorophénolindophénol (DIP) décrite par Klein et Perry, (1982) avec quelques modifications (Yen et al , 2008)

Equations du dosage

Acide ascorbique 2H⁺ + 2e^- + acide déhydroascorbique Dichlorophénol-indophénol + 2H⁺ + 2e^-  leucodérivé réduit

Equation-Bilan

Acide ascorbique + 2,6-DCPIP  A. déhydroascorbique + dérivé réduit

Mode opératoire

 0,5 g de fruit sec (jujube) coupé en petits morceaux est extraite avec 10 ml d’acide oxalique (1%) ;

 L’extrait est centrifugé à 3000 tours/min pendant 15 minutes ;

 On mélange 5 ml de surnageant avec 9 ml de DIP à 0,2mM, bien mélanger pendant 15 secondes, puis l’absorbance est mesurée à 515nm.

 La courbe d’étalonnage est réalisée en utilisant l’acide ascorbique comme standard avec une gamme de concentration allant de 0 à 500 µg pratiqué dans les mêmes conditions opératoires que les échantillons.

 Les résultats obtenues de la teneur en acide ascorbique sont exprimés µg/g de Zizyphus brut.

V.4. dosage des composés du métabolisme secondaire V.4.1. Dosage des composés phénoliques

La teneur en composés phénoliques de l’extrait EEZ du fruit de Zizyphus jujuba a été estimée par la méthode de Folin-Ciocalteu selon Singleton et al,(1999). Cette technique est basée sur la réduction en milieu alcalin du mélange phosphotungstique - phosphomolybdique et réactif de Folin par les groupements oxydables des composés phénoliques, conduisant à la formation de produits de réduction de couleur bleue. Ces derniers présentent un maximum d’absorption à 765 nm et dont

l’intensité est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans l’échantillon

(George et al, 2005).

0.5 ml de l’extrait EEZ est ajouté à 5 ml d’eau distillée. 0.5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu sont additionnés. Après 3 min, 0.5 ml d’une solution de carbonate de sodium 100mg/ml sont ajoutés. Après mélange initial, les flacons opaques sont laissés au repos pendant 2 h. La densité optique des échantillons de couleur bleue est mesurée à 765 nm. Les concentrations en polyphénols sont déduites à partir de la gamme d’étalonnage établie avec différentes concentrations d’acide gallique (15,6 µg/ml à 2 mg/ml) et sont exprimées en milligramme équivalent d’acide gallique par 100 g de matière sèche (mg EAG/100g MS).

V.4.2. Dosage des flavonoïdes totaux

Les flavonoïdes totaux de l’EEZ sont évalués à l’aide d’un test colorimétrique légèrement modifié selon Zhishen et al, 1999. Dans un tube sont introduits successivement 25 mL de l’extrait EEZ et 100 µL d’eau distillée. Au temps initial (0 minute), 7,5 mL d’une solution de NaNO2 (5 %) sont ajoutés. Après cinq minutes 7,5 mL d’AlCl3 (10 %) sont additionnés. A six minutes, 50 mL de NaOH (1 N) et 0,25 ml d’eau distillée sont ajoutés successivement au mélange. L’absorbance de ce dernier dans l’UV-visible est mesurée à 510 nm contre un témoin. Les résultats sont exprimés en mg équivalent quercétine par gramme de matière sèche (mg EQ/g MS).