Dosage des paramètres biochimiques

L’analyse des paramètres sériques est effectuée suivant des méthodes enzymatiques ou colorimétriques.

II.6.1. Dosage de la glycémie

La glycémie a été déterminée par une méthode enzymatique (Hexokinase /G-6-PDH) en utilisant le Kit de réactif de glucose biomérieux.

Principe : Le dosage du glucose est basé sur une double réaction enzymatique : la

glucose-oxydase (GOD) oxyde le glucose en acide gluconique et en peroxyde d'hydrogène (H2O2). Ce dernier permet l’oxydation de l’o-dianisidine en un produit coloré grâce à une

autre enzyme, la peroxydase. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en glucose. À partir d’une courbe étalon, on peut déterminer graphiquement la teneur en glucose d’une solution en mesurant son absorbance à 505 nm par spectrophotométrie.

II.6.2. Dosage des marqueurs de l’hépatotoxicité

II.6.2.1. Dosage de l’aspartate aminotransférase (ASAT)

Le dosage de l’aspartate aminotransférase a été réalisé par la méthode cinétique selon la fiche technique du Kit biomérieux (France).

Principe: Détermination cinétique de l’activité aspartate aminotransférase. La réaction

est initiée par addition de l’échantillon au réactif. Le schéma réactionnel est le suivant: 2 oxoglutarate + L-Aspartate ALAT Glutamate + oxaloacetate Oxalocetate + NADH + H+ MDH Malate + NAD+

Le taux de diminution de la concentration en NADH est directement proportionnel à l’activité aspartate amino transferase dans l’échantillon. GOT: Transaminase flutanique oxaloacétique MDH: Malate Dehydrogenase. Lecture à 340 nm(Bergmeyer, 1976).

II.6.2.2. Dosage de l’alanine aminotransférase (ALAT)

Le dosage de l’alanine aminotransférase a été réalisé par la méthode cinétique selon la fiche technique du Kit biomérieux (France).

Principe : l’alanine aminotransférase (ALAT) appelée aussi la glutamate-pyruvate

transaminase (GPT) catalyse le transfert réversible d'un groupe aminé à partir de l'alanine au α-cétoglutarate formant le glutamate et le pyruvate. Le pyruvate est réduit au lactate par la lactate-déshydrogénase (LDH) et le NADH. Lecture à 340 nm (Bergmeyer, 1980).

II.6.2.3.Dosage de la phosphatase alcaline (PAL)

Le dosage de la phosphatase alcaline (PAL) a été effectué suivant une méthode enzymatique colorimétrique en utilisant les kits BioVision (BioVision, USA).

Principe : Le substrat phosphate p-nitrophényl est hydrolysé par la Phosphatase Alcaline

de l’échantillon, en présence d’ions Magnésium, pour former du p-nitrophénol de couleur jaune qui peut être lu à 405 nm. L’intensité de la couleur produite est proportionnelle à l’activité de la phosphatase alcaline présente dans l’échantillon (Thomas, 1998).

II.6.2.4.Dosage de la 5’-Nucleotidase

Le dosage de la 5’-Nucleotidase est déterminée par une méthode colorimétrique enzymatique (kit BioVision, USA).

Principe : La 5'-nucléotidase est une enzyme catalysant l'hydrolyse des nucléosides

inosine 5'-monophosphates en nucléosides et en phosphate inorganique. L'enzyme est largement distribuée dans les tissus humain et animal. L'activité présente dans le sérum est libérée de la membrane des cellules hépatiques par les sels biliaires et est utilisée comme marqueur pour l'hépatopathie.

II.6.2.5. Dosage de la bilirubine totale

La bilirubine totale est la somme des fractions conjuguée et libre. La bilirubine totale est élevée dans les affections provoquant l’obstruction des voies biliaires, l’hépatite, la cirrhose, les troubles hémolytiques et plusieurs carences enzymatiques héréditaires.

Principe : Le dosage de la bilirubine est basé sur la réaction entre la bilirubine et les

solutions d’acide sulfanilique diazoté. Dans une solution aqueuse, seule la bilirubine directe (conjuguée) réagit de cette manière. Ce réactif de dosage de la bilirubine directe utilise une

méthode à l’acide diazoté. La bilirubine conjuguée réagit avec l’acide sulfanilique diazoté pour produire une azobilirubine acide, dont l’absorbance est proportionnelle à la concentration de bilirubine directe dans l’échantillon et doit être mesurée à 555 nm (Walters, 1970).

II.6.2.6. Dosage du gamma GT

La gamma-glutamyl transférase (γ -GT) est une enzyme qui est présente dans quasiment tous les tissus de l’organisme, elle apparaît notamment dans le foie, le pancréas, les reins et la prostate.

Principe : La gamma-glutamyl transférase (γ -GT) catalyse le transfert d’un groupe γ -

glutamyl de la γ -glutamyl-p-nitroanilide au dipeptide accepteur glycilglycine (Persijn et al., 1976).

II.6.3. dosage des marqueurs de la néphrotoxicité II.6.3.1. Dosage de l’urée

L’urée est déterminée par la méthode calorimétrique enzymatique (Kit Chronolab, System) (Berthelot, 1998) selon la réaction suivante :

Uréase

Urée + H2O 2NH3 + CO2

L’urée présente dans l’échantillon donne en présence d’uréase et de nitroprussiate un indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie à 580 nm.

II.6.3.2. Dosage de la créatinine

Le dosage de la créatinine a été réalisé par la méthode cinétique colorimétrique selon la fiche technique du Kit biolabo (France).

Principe : La créatinine est déterminée par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit

Biocon, Germany). La créatinine présente dans l’échantillon réagit avec le picrate en milieu alcalin, pour donner un complexe coloré. La vitesse de formation de ce complexe est mesurée dans des périodes initiales courtes, en évitant ainsi l’interférence avec d’autres composés. La lecture se fait à une longueur d’onde λ=500 nm (Whelton et al., 1994).

II.6.3.3. Dosage de l’acide urique

Le dosage de l’acide urique a été réalisé par la méthode enzymatique colorimétrique selon la fiche technique du Kit Biolabo (France).

Principe : l'acide urique est oxydé par l’uricase en allantoïne et peroxyde d'hydrogène (2

H2O2) qui, sous l'influence de la peroxydase, du 4-aminophénazone (4-AP), et du 2-4

dichlorophénol-sulfonate (DCPS), forme un composé rouge de quinonéimine.

L’intensité de la coloration rouge formée est proportionnelle à la concentration de l’acide urique dans l’échantillon (Schultz, 1984).

II.6.4. dosage des marqueurs de la cardiotoxicité II.5.4.1. Dosage de la Créatine Kinase mb

La CK-mb est l’une des trois formes de l’enzyme Créatine Kinase (CK).

Le dosage de la CKmb par la technique d’immuno-inhibition se fait par séparation électrophorétique sur gel d’agarose à haut voltage (900 V) avec révélation enzymatique et quantification en fluorescence. Le résultat est obtenu en 30 minutes.

II.6.4.2. Dosage de la troponine totale

Dosage de la Troponine T représente un des isoformes spécifiques du myocarde.

Principe : Le dosage de la troponine T est commercialisé par une seule firme:

BOEHRINGER MANNHEIM, en utilisant la méthode ELISA. Les anticorps utilisés de 2ème génération sont cardio-spécifiques. L'un des anticorps est fixé sur un support solide, l'autre est marqué par une enzyme. Le signal généré par la réaction est proportionnel à la concentration de l'échantillon(Collinson, 1993).

II.6.4.3. Dosage du lactate déshydrogénase (LDH)

Le dosage du lactate déshydrogénase a été réalisé par la méthode cinétique selon la fiche technique du Kit biolabo (France).

Principe : le lactate déshydrogénase (LDH) catalyse la réduction du pyruvate par le

NADH (Pesce, 1984). Le taux de diminution de la concentration en NADH est directement proportionnel à l’activité lactate deshydrogenase dans l’échantillon.

II.6.4.4. Dosage du peptide natriurétique de type B (BNP)

Le dosage de la peptide natriurétique de type B peut servir à évaluer la gravité de l'insuffisance cardiaque, qui est en corrélation avec la classification définie par la New York Heart Association (Wieczorek et al., 2002).

Principe : c’est un dosage immunologique dans le but est la détermination quantitative

du peptide natriurétique humain de type B (BNP) dans le plasma humain prélevé sur EDTA, en utilisant la technologie de dosage immunologique microparticulaire par chimiluminescence (CMIA) avec des protocoles de dosage flexibles, appelée Chemiflex.