DOSAGE DES ANTHOCYANES

Les anthocyanes totales, At, se trouvent dans le vin sous plusieurs formes : les anthocyanes à l’état libre, Al, et les anthocyanes combinées aux tanins, Ac, dont une fraction est décolorable par le SO2²⁰⁴, TA, et l’autre insensible à ce réactif, TAT :

At = Al + Ac = Al + TA + TAT

Le dosage que nous avons réalisé dans cette étude nous permet donc d’obtenir la teneur de la fraction Al + TA soit en majorité les anthocyanes sous forme libre.

Pour cela, une solution mère composée de 0,5 mL d’échantillon de vin, 0,5 mL d’éthanol à 0,1% vol. et 10 mL d’HCl à 2% vol. est constituée. 5 mL de cette solution mère sont déposés dans deux tubes à essai, additionnés pour l’un de 2 mL d’eau distillée (tube témoin) et pour l’autre de 2 mL d’une solution de bisulfite de sodium à 15% (tube bisulfite) où la décoloration des anthocyanes est observée. La lecture au spectrophotomètre se réalise après 20 min d’attente à 520 nm et les concentrations en anthocyanes, en mg/L, sont établies à l’aide de la formule²⁰⁴ :

78 2.6.4 DETERMINATION DU DEGRE DE POLYMERISATION MOYEN DES TANINS (DPM)

La détermination du DPm est basée sur la dépolymérisation des tanins par rupture des liaisons interflavanes en milieu acide et à chaud en présence d’un agent nucléophile. Elle permet de récupérer l’unité terminale et de bloquer l’unité d’extension sous la forme d’un monomère substitué par l’agent nucléophile en position C4 du flavan-3-ol.

La solution est alors analysée par CLHP en phase inverse. Il est ainsi possible, dans la mesure où la dépolymérisation est totale, de déterminer la composition en monomères et le degré de polymérisation moyen (DPm).

Le degré de polymérisation (DPm) a été évalué par phloroglucinolyse^{205, 206, 207} en utilisant comme agent nucléophile le phloroglucinol. Le mécanisme de la phloroglucinolyse est décrit dans la Figure 39.

79 Pour les procyanidines, les unités terminales libérées sont la (+)-catéchine (C), la (-)-épicatéchine (EC) et la (-)-(-)-épicatéchine galloylée (ECG). Les unités d’extension sont sous la forme d’adduit de phloroglucinol : adduits (+)-catéchine–phloroglucinol (C-P) 1 et 2, (-)-épicatéchine phloroglucinol (EC-P) et (-)-(-)-épicatéchine galloylée phloroglucinol (ECG-P). Les prodelphinidines libèrent en plus la (-)-epigallocatéchine (EGC) et son adduit phloroglucinol (EGC-P).

2.6.4.1 PREPARATION DES ECHANTILLONS

Une préparation est nécessaire afin de purifier les vins et de concentrer les échantillons.

5 mL de vin ont été concentrés sous pression réduite afin de retirer l’éthanol (1-2 mL). Le volume a ensuite été ajusté à 20 mL avec de l’eau distillée. Une étape de purification sur cartouche C18 (12 g) (Supelco, Saint Quentin Fallavier, France) a été ensuite réalisée. Après conditionnement de deux cartouches avec du méthanol (1 v) et avec de l’eau distillée (1 v), 10

80 mL d’échantillon ont été déposés en tête de la colonne. Après un lavage à l’eau (50 mL), l’élution a été réalisée avec 50 mL de méthanol. Les fractions méthanol sont associées, évaporées à sec sous pression réduite puis reprises dans 2 mL de méthanol. L’échantillon est ainsi concentré 2,5 fois par rapport au vin de départ. Cette procédure a été effectuée deux fois pour chaque vin.

Pour la réaction de dépolymérisation, le mélange réactionnel composé de 100 µL d’échantillon et 100 µL de réactif de phloroglucinolyse a été chauffé à 50°C pendant 20 min. Ce réactif est un mélange de phloroglucinol (50 g/L) et d’acide ascorbique (10 g/L) dissout dans du méthanol acidifié à 0,1 N d’acide chlorhydrique. Cinq volumes de la solution aqueuse d’acétate de sodium (40 mmol/L) sont ajoutés pour arrêter la réaction. Chaque réaction de phloroglucinolyse est dupliquée. Chaque échantillon a été injecté trois fois.

2.6.4.2 DOSAGE DES PRODUITS DE REACTION PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (CLHP) ET CALCUL DU DPM

Les produits de la réaction ont été analysés au moyen du système de chromatographie CLHP Thermo scientific Accela équipée d’une colonne en phase inverse Xterra RP18 (100 x 4,6 mm, 3,5 µm). Le débit est fixé à 1 mL/min, le volume d’injection est de 20 µL et la longueur d’onde de détection est de 280 nm. Les analyses ont été réalisées à température ambiante (20°C). Le solvant A est un mélange eau déionisée/acide acétique (99/1) et le solvant B du méthanol. Le gradient d’élution est le présenté dans le Tableau 11.

Tableau 11. Gradient d’élution pour la détermination du DPm du vin

Temps (min) 0 25 45 70 71 80 85

% de solvant A 95 95 80 60 100 100 5

% de solvant B 5 5 20 40 0 0 95

L’identification des composés a été possible par la recherche de leur masse moléculaire d’ionisation spécifique (Tableau 12).

81 Tableau 12. Composés formés lors de la phloroglucinolyse et masses moléculaires d’ionisation spécifique Composés Masses [M-H]+ (-)-épigallocatéchine 305 adduit (-)-épigallocatéchine-phloroglucinol 565 (+)-catéchine 289 adduit (+)-catéchine-phloroglucinol 413 (-)-épicatéchine 289 adduit (-)-épicatéchine-phloroglucinol 413 (-)-épicatéchine gallate 441

adduit (-)-épicatéchine gallate-phloroglucinol 565

Le dosage des produits par CLHP en phase inverse de la dégradation permet le calcul du degré moyen de polymérisation (DPm).

DPm=∑ Concentrations en unités terminales flavan-3-ols (+ ∑ Concentrations en unités d^'extension

∑ Concentrations en unités terminales libérées (flavan – 3 – ols )

2.6.5 DOSAGE DES ELLAGITANINS MOLECULAIRES

2.6.5.1 EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE

Le vin est un milieu riche en différents composés (tanins du raisin, anthocyanes, etc.) et en général les ellagitanins y sont présents en moindre quantité. Pour cette raison, un fractionnement du vin sur phase solide est préalablement effectué avant l’analyse CLHP-MS^91,

208. En effet, sans celui-ci, le bruit de fond généré par les molécules non ellagiques est trop important et masquerait le signal des ellagitanins⁸⁸.

Le gel TSK, qui permet de retenir les tanins de manière sélective par rapport aux autres polyphénols est utilisé pour effectuer ce fractionnement209,210. Une colonne (130 mm x 25 mm (h X Ø)) est remplie de gel TSK HW 50 F sur une hauteur de 55 mm puis laissé pendant une nuit dans du méthanol afin de l’activer. Le lendemain, la colonne est lavée avec 50 mL d’eau acidifiée par 0.4% d’acide formique. Le fractionnement est ensuite réalisé sur 120 mL de vin déposés en tête de colonne par volumes successifs de 10 mL. Le vin chargé en tête de colonne est d’abord lavé grâce à 50 mL d’eau distillée acidifiée (H2O/HCOOH (996/4)) qui permet l’élimination de l’acide tartrique et des sucres résiduels. Puis, 100 mL de solvant hydrométhanolique acidifié (H2O/MeOH/HCOOH (298/698/4)) permettent d’éliminer du gel

82 la majeure partie des polyphénols. Enfin, les ellagitanins sont récupérés sous l’action de 100 mL d’une solution eau distillée/acétone, acidifiée par de l’acide formique (298/698/4). Cette dernière fraction, supplémentée par 1 mL d’eau déionisée à 20 mg/L d’acide chlorogénique (étalon interne), est évaporée à sec sous pression réduite à 30°C puis le résidu est repris dans 1 mL d’eau déionisée acidifiée (H2O/HCOOH (996/4)) à l’aide d’un sonicateur, filtré (0,45 µm) et placé dans un vial CLHP muni d’un réducteur⁸⁸. L’acide chlorogénique, détectable en masse en mode négatif a été utilisé comme étalon interne.

2.6.5.2 ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE COUPLEE A UN DETECTEUR DE MASSE (MS)

Le dosage moléculaire des ellagitanins consiste à quantifier les huit ellagitanins du bois solubilisés dans le vin (castalagine, vescalagine, grandinine, roburine A roburine B, roburine C, roburine D et roburine E) à l’aide de chacun de leurs pics après séparation et détection au spectromètre de masse. Pour cela, 20 µ L de la fraction de vin repris dans de l’eau acidifiée décrite précédemment sont injectés dans une CLHP Thermo scientific Accela équipée d’une colonne Lichrospher 100 RP 18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) à travers laquelle les solvants circulent au débit de 1 mL/min. Le solvant A utilisé correspond à de l’eau déionisée à 0,4% d’acide formique alors que le solvant B est du méthanol à 0,4% d’acide formique. Le gradient d’élution adapté est donné dans le Tableau 13. La quantification des ellagitanins moléculaires est effectuée avec un détecteur de masse puis exprimée en équivalent vescalagine grâce à l’équation de régression linéaire de la gamme étalon (200, 100, 50, 25, 12,5 et 6,25 mg/L). L’acide chlorogénique, les roburines A et D, la castalagine et la vescalagine, les roburines B et C, la grandinine et la roburine E sont quantifiés respectivement à m/z = 353, 924, 933, 990 et 1065 ± 0.5 m/z. Les seuils de détection et de quantification ainsi que la répétabilité et la reproductibilité de la méthode sont évalués selon la recommandation de la résolution OIV OENO 7/2000 (Tableau 14).

Tableau 13. Gradient d’élution utilisé pour le dosage des ellagitanins moléculaires d’un vin

Temps (min) 0 5 25 75 77 87 89 94

% de solvant A 100 100 97 80 0 0 100 100

83 Tableau 14. Limites de détection et de quantification de la vescalagine, répétabilité et reproductibilité de la méthode CLHP-MS Composé Limite de détection (mg/L) Limite de quantification (mg/L) Répétabilité (%) Reproductibilité (%) Masse [M-H]- Vescalagine 0,18 0,59 2,59 4,59 933