L!&:3.$2($MFN.-$,7$2(;,3(N3N(.N&#-2N$2(2:.(#$2(=; O#$2(=:.-,2(.N2-23&,32($3(2$,2-J#$2(&:M(.N7:..$,7$2( de la TO chez les souris Swiss-Webster et C57Bl/6 &F.O2(:,(=;-2( !-,>$73-;,(2?23N=-P:$*
Dosage des anticorps IgG1 et IgG2a dans les souris résistantes Swiss-Webster Les souris Swiss-Webster sont les seules à produire des anticorps IgG et IgA lors des récurrences de la TO au cours de nos expériences. Les anticorps IgG étant produits en quantités plus importantes (Fig 2 B publication).
Nous avons également dosé les deux sous-7#&22$2( !&,3-7;.F2(Q'1 les plus présentes dans le sérum: les IgG1 et Q'1R&($3(F;:%&,3(N%$,3:$##$=$,3(&%;-.(:,(.S#$( &,2(#!T-# (Fig 38). Les IgG1 et les IgG2a sont des marqueurs des l?=F<;7?3$2(G<R($3(G<A(.$2F$73-%$=$,3*(0$2($MFN.-$,7$2(,!;,3(N3N(.N&#-2N$2( P:!:,$( >;-2E( :( >&-3( $( #!:3-#-2&3-;,( $2( <:=$:.2( &P:$:2$2( F;:.( #$2( &:3.$2( $MFN.-$,7$2( 7;==$( #$( Bioplex et les dosages des anticorps IgG et IgA. Cependant, nous pouvons malgré tout observer une forte présence des anticorps IgG1 anti-toxoplasmes à 3 et 21 jours post-réinfection, ce qui indique une forte réponse Th2. Alors que les anticorps IgG2a, marqueurs de la voie Th1, ne semblent pas augmenter de façon significative.
0 3 7 21
0 5 10 15 IgG1
Days post reinfection
In d e x (r e in fe c te d -i n fe c te d ) 0 3 7 21 0 1 2 3 In d e x (r e in fe c te d -i n fe c te d )
Days post reinfection
IgG2a
180
Localisation de kystes dans les rétines infectées
Des kystes ont été trouvés à plusieurs reprises dans les rétines des souris infectées, principalement chez les souris C57Bl/6 (Fig 39). Les kystes sont situés au niveau des couches ganglionnaire et nucléaire internes. Aucune inflammation péri-@?23-P:$(,!$23( .$=&.P:N$*( Des expérienc$2( !UVG( /3;=;'.&F<-$( $( 7;<N.$,7$( ;F3-P:$8( $3( $( >;, ( !T-#( 2$.&-$,3( F&.3-7:#-O.$=$,3( -,3N.$22&,3$2( W( réaliser successivement afin !&%;-. :,$(%:$('#;J&#$( $(#!N3&3( $(#&(.N3-,$(2;:2( ->>N.$,32(&,'#$2*
Figure 39 : Présence de kystes dans les rétines de souris réinfectées C57Bl/6 et Swiss-Webster.
X,&#?2$( $2(3.&,27.-32(&F.O2(.N-,>$73-;,($,(>;,73-;,( :(>;, ('N,N3-P:$( $(#!<S3$( Les transcrits dosés dans les rétines des souris Swiss-Webster réinfectées avec une souche de type II, PRUE(=;,3.$,3(:,$(&:'=$,3&3-;,(=; N.N$( $(#!$MF.$22-;,( $(#!Q6Y->E(#!Q0-10, de TGF-? et de #!Q0-27 et des facteurs de transcription GATA-3 (Th2) et T-bet (Th1) à 3 ou 7 jours après réinfection (Fig 40). Chez ces souris, la réponse immunitaire mise en place semble être notamment de type Th1 et T .N':#&3.-7$*(Z,$(&:'=$,3&3-;,( $(#!$MF.$22-;,( $([Q6-1@ $3( !Z[6)-1 est observée 7 jours &F.O2(#&(.N-,>$73-;,E($3(-#($,($23( $(=\=$(F;:.(#!$MF.$22-;,( $(6;M]K(W(RA(^;:.2(&F.O2(#&(.N-,>$73-;,*( Cependant, ces augmentat-;,2(2;,3(3.O2(>&-J#$2($3(=N.-3$.&-$,3( !\3.$(%N.->-N$2(&>-,( $(2!&22:.$.( !:,( potentiel rôle de ces facteurs lors de la réinfection chez des souris résistantes.
181
Figure 40 : AB)1*$C$%)*$,1&'!3&*")13%"$*3&-,"3&'7B1!&"D$1C!%*$,1&)#ec une souche de type II chez des souris Swiss-Webster. Ordonnées: mRNA x100/mRNA HPRT ; Abscisses : jours post infection
Les transcrits dosés dans les rétines des souris C57Bl/6 réinfectées avec une souche PRU laissent apparaître une &:'=$,3&3-;,( $(#!Q6Y-> $3( $(#!Q0-AD(_(^;:.2(&F.O2(.N-,>$73-;,E(F:-2( $(#!Q0-17 plus tardivement (Fig 41)*(Z,$(>&-J#$(&:'=$,3&3-;,( $(#!$MF.$2sion des transcrits de FoxP3 et !Z[)6-1 est également possible à 2!Z[)6-1 jours après la réinfection mais cela reste à confirmer.
Figure 41 : AB)1*$C$%)*$,1&'!3&*")13%"$*3&-,"3&'7B1!&"D$1C!%*$,1&)#!%&B1!&3,B%+!&(E5&%+!F&'!3&3,B"$3&0G:H-I9. Ordonnées : mRNA x100/mRNA HPRT ; Abscisses : jours post infection
182
La réponse immunitaire des souris C57Bl/6 diffère principalement de celle des souris Swiss-`$J23$.(F&.(#!&:'=$,3&3-;,( :(3.&,27.-3( $(#!Q0-17 appartenant à la voie Th17 et reconnu comme N3&,3(:,(>&73$:.( N#N3O.$( &,2(#!T-# (Sauer et al, 2012).
Localisation des cellules et des cytokines dans les rétines réinfectées
Nous avons cherché à localiser dans les rétines infectées les cellules et les cytokines potentiellement présentes, nous autorisant ensuite à comparer les résultats obtenus entre les deux souches de souris &>-,( $(=$33.$($,(N%- $,7$( !N%$,3:$##$2( ->>N.$,7$s.
Les cellules et cytokines présentes dans les rétines infectées des souris Swiss-Webster et C57Bl/6 sont les leucocytes (marquage CD45) qui sont exprimées en plus grand nombre dans les couches ganglionnaire et plexiforme externe pour les deux races de souris ; les microglies (marquages CD11b) exprimées dans la couche ganglionnaire ; les lymphocytes T (marquage CD4) sont également présents dans la couche ganglionnaire (Fig 42). La cytokine IL-12 est fortement exprimée chez les souris réinfectées dans les couches plexiformes interne et externe pour les souris Swiss-`$J23$.($3(N'&#$=$,3( &,2(#&(7;:7<$('&,'#-;,,&-.$(F;:.(#$2(2;:.-2(VC_I#Ba*(0$2(-=&'$2( $(#!Q0-6 sont grossies afin de pouvoir apprécier le marquage cytoplasmique de certaines cellules ganglionnaires.
183
Dosage des cytokines et chémokines contenues dans les humeurs aqueuses des
souris réinfectées
Deux chimiokines sont augmentées dans les humeurs aqueuses des souris réinfectées C57Bl/6, !"#-1 et MIP-!"#-1!., les autres facteurs $!%&'$& pas affectés. Les figures sont présentées sous forme (!)$(*+ : (humeur aqueuse des souris réinfectées) / (moyenne des humeurs aqueuses des souris infectées + injection intraoculaire de PBS). Une quantification des protéines de la voie Th17 a été réalisée sur les humeurs aqueuses des souris C57Bl/6 (cf publication),-#!.$)/.*-01&23)$*-(*-0*&&*-42)*-/.)-*5&-'.67*$&%*-*5&- !"#-17F dans les humeurs aqueuses des souris C57Bl/6. Son rôle au 02.85-(!.$*-9:-$!*5&-;'5-02$$.-<- !=*.8*-'0&.* *,
Figure 43 : Quantification protéique dans les humeurs aqueuses des souris Swiss-Webster et C57Bl/6.
Neutralisation des cytokines (!)$&%8>&-0=*?- *5-52.8)5-5*$5)@ *5-ABCD EF
La cytokine IL-FG- /.)- *5&- H28&*7*$&- '.67*$&%*- 285- (!.$*- 8%)$H*0&)2$- '4*0- .$*- 52.0=*- 7.8)$*-5*$5)@ *G- '- %&%- $*.&8' )5%*- 'H)$- (!%&.()*8- 5*5- H2$0&)2$5- 285- (!.$*- 8%0.88*$0*- (*- '- 9:,- I)$5)G- la $*.&8' )5'&)2$-(*- !"L-6 entraine une production de cytokines et chimiokines moins importantes que 285-(!.$*-)$H*0&)2$-$287' * (Fig 44),-#*5-;82&%)$*5-)7;'0&%*5-52$&-*$&8*-'.&8*5- !"#-JKG- !"#-1 , MCP-1 et MIP-1 . Les facteurs de la voie Th2 (IL-3, IL-4 et IL-5) sont très légèrement plus faibles alors que la production des facteurs comme KC ou GM-CSF ne sont pas modifiées.
184
Figure 44 : "#$%&'(')$&'*%+,-.+)/&*0'%-.+-&+)1'2'*0'%-.+3*4.+,-.+-5674'-%)-.+,-+%-#&4$3'.$&'*%+,-+389:-6 au cours ,8#%-+;<+récurrente.
#!"LM-= *5&- !'.&8*-01&23)$*-)7;28&'$&*- 285-(*- '-8%0.88*$0*-0=*?- *5-52.8)5-ABCD EF,-N2$-8O *-'-donc également été investigué. La $*.&8' )5'&)2$-(*- !"LM-= influence également les facteurs MIP-1! et G- !"#-MIP-1! *&- !"#-13 avec une quantité protéique plus faible,- #'- $*.&8' )5'&)2$- (*- !"LM-= $!)$H .*$0*-;'5- '-;82(.0&)2$-(*- !"#-JC-7')5-'.67*$&*-0* *-(*- !"#-6 (cf publication).
185
P&.(*-(*- !)$H .*$0*-(*- '-42)*-Q'3EN9I9- 285-(*5-8%0.88*$0*5-(*- '-9:
Un transcriptome sur la voie Jak/STAT a été réalisé dans le but de définir les facteurs pouvant être impliqués lors des récurrences. Cette analyse a été effectuée sur les 3 souches de souris : Swiss-Webster, C57Bl/6 et CBA/J uniquement au R2.8-C-;25&-8%)$H*0&)2$,-N.8- !*$5*7@ *-(*5-8%5. &'&5-obtenus, nous nous sommes intéressés à deux facteurs qui différent totalement entre nos deux souches de souris,-" -5!'6)&-(*-N:ANS-TN.;;8*5528-:H-A1&23)$*-N)6$' )$6-SU-*&-(!"NVJB-T"$&*8H*82$-Stimulated Gene 15). Ces deux protéines sont, comparées aux autres facteurs, fortement surexprimées chez les souris Swiss-W*@5&*8- 285- (!.$*- 8%0.88*$0*- &'$()5- /.!* *5- $*- 52$&- ;'5-exprimées chez les C57Bl/6. SOCS3 est un facteur bien connu qui permet de réguler négativement les voies de signalisation de certaines cytokines, (2$&- !"#-F-*&- !"LM-= ainsi que celles de la voie 9=JC,-#285-(!.$)$H*0&)2$-&2+2; '57)/.*G-N:ANS-;827*.&- '-8%;2$5)77.$'H)$-(02$&8O *8- *-parasite. ISG15, quant à lui, est principalement réputé ;2.8-52$-'0&)2$-'$&)4)8' *,-A!*5&-.$*-;82&%)$* 5)7) ')8*-<- !ubiquitine qui est induite principalement en réponse aux interférons de type I. Elle est sécrétée par les monocytes et les lymphocytes et peut fonctionner comme une cytokine *+&8'0* . ')8*-*&-)$(.)8*- '-;82(.0&)2$-(!"LM-=. #*5-8%5. &'&5-2@&*$.5-52$&-;8%5*$&%5-52.5-H287*-(!.$-tableau récapitulatif en annexes (Tableau 4). La présence de ces deux facteurs chez les souris Swiss-Webster pourrait également expliquer le contrôle de la charge parasitaire et la faible pathologie oculaire lors de récurrences de la TO dans ce modèle.
#20' )5'&)2$-0* . ')8*-(*-N:ANS-*&-(!"NVJB-('$5- *5-8%&)$*5-8%)$H*0&%*5
Des immuno-7'8/.'6*5-2$&-%&%-*HH*0&.%5-'H)$-(!'HH)87*8-*&-(*- 20' )5*8-N:ANS-*&-"NVJB,-N:ANS-apparait dans la couche ganglionnaire des rétines infectées des souris résistantes Swiss-Webster 7')5-$!*5&-;'5-2@5*84%-0=*?- *5-52.8)5-5*$5)@ *5-ABCD EF (Fig 46). ISG15 a également été localisé dans la couche ganglionnaire des rétines des souris Swiss-Webster infectées et réinfectées. Les 7'8/.'6*5- (!"NVJB- ;2.8- *5- 52.8)5- ABCD EF- 5*82$&- 8%' )5és prochainement. Ces premières expériences seront confirmées par des marquages immuno-=)5&20=)7)/.*5- ;.)5/.*- !'$&)028;5-"NVJB-$!*5&-;'5-)$()/.%-;2.8-(*5-02.;*5-<- '-02$6% '&)2$,
186
Figure 46 : Localisation de SOCS3 dans les rétines réinfectées.