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4.1) Procedimentos in vivo

4.1.1) Tratamento dos animais com IFN beta

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA/IB/UNICAMP, processo 793 -1) e todos os experimentos foram realizados de acordo com as instruções do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Foram utilizados 60 camundongos adultos fêmeas (6 a 8 semanas, 20-25 gramas) pertencentes à linhagem C57BL/6J que foram obtidos no Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Os animais foram divididos em três grupos experimentais: grupo 1 (animais submetidos à lesão do nervo isquiático unilateral), grupo 2 (animais submetidos à lesão do nervo isquiático e que receberam tratamento placebo), grupo 3 (animais submetidos à lesão do nervo isquiático e que receberam tratamento com interferon beta, IFN beta). Dentro de cada grupo os animais foram separados em subgrupos com n=5 para as seguintes técnicas: imunohistoquímica, hibridação in situ, western blotting e microscopia eletrônica, sendo que para essa última técnica os cinco animais do grupo 1 foram substituídos por animais sem qualquer lesão nervosa e sem qualquer tratamento.

O IFN beta (betaferon® , Chiron Co, EUA) foi administrado de forma subcutânea na dose de 10.000 UI (Unidades Internacionais) diluídas em 0,20 ml de tampão fosfato (PB, phosfate buffer) estéril pH 7,4 (Yu et al., 1996; Tuohy et al., 2000). As aplicações foram realizadas em dias alternados durante duas semanas. No oitavo dia de tratamento, os animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico e, posteriormente, ao final do tratamento, no 15° dia, os mesmos foram submetidos à eutanásia. O mesmo esquema de

tratamento foi mantido para o grupo placebo, sendo, utilizado a administração de 0,20 ml de solução tampão como placebo.

4.1.2) Procedimento cirúrgico: Transecção do nervo isquiático

Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (1:1; 0,10ml/25g, i.p.) e submetidos à transecção do nervo isquiático esquerdo próximo ao forame obturado, com remoção de um segmento de dois milímetros do coto distal do nervo, com o intuito de evitar-se um eventual processo regenerativo (Figura 4).

4.1.3) Eutanásia dos animais

Os animais foram submetidos à eutanásia através de overdose de anestésico e toracotomia. A seguir, os mesmos foram perfundidos transcardiacamente com auxílio de bomba perfusora do tipo peristáltica. Inicialmente, visando a lavagem total dos vasos sanguíneos e órgãos, os animais foram perfundidos com 20 ml de solução salina tamponada e heparinizada (NaCl 0,9% em PB, pH 7,4). A fixação foi realizada pela subseqüente perfusão de 20 ml de solução fixadora, a qual variou conforme a técnica de análise utilizada.

Após fixação, o conjunto, contendo a intumescência lombar e raízes nervosas, foi extraído e dissecado e, posteriormente, imerso na mesma solução fixadora utilizada na perfusão durante 12 horas sob uma temperatura de 4ºC.

4.1.4) Imunohistoquímica

A solução fixadora tamponada utilizada para este procedimento constituiu-se de formaldeído 4% em PB 0,1M, pH 7,4.

Após 12 horas de fixação em temperatura de 4°C, as medulas foram desidratadas em sacarose 20% e incluídas em Tissue-Tek (Miles Inc., USA) e congeladas a -40ºC em isopentano resfriado em nitrogênio líquido. Dos blocos congelados com o material foram obtidos cortes histológicos em criostato (-25°C, Microm, Heidelberg, Germany) com espessura de 12 µm. As secções foram então transferidas para lâminas gelatinizadas previamente climatizadas. As lâminas prontas, contendo os cortes histológicos de medula, foram estocadas a -20ºC até a realização da técnica.

As lâminas foram colocadas em temperatura ambiente para a climatização, sendo então, imersas e lavadas por três vezes em PB 0,01M. Em seguida, as lâminas foram incubadas em câmara úmida com 150 µl de solução de albumina bovina 3% em PB 0,01M, pH 7,4 por 30 minutos. Após este período, as secções foram novamente lavadas em PB 0,01M, pH 7,4 e os anticorpos primários aplicados, com período de incubação de 18 a 24 horas sob temperatura de 4°C. Os anticorpos primários empregados foram: rato anti-MHC I (1:100, Península), coelho anti-sinaptofisina (1:200, Dako), uma porteína localizada no interior de vesículas dentro dos terminais pré-sinápticos é uma forma indireta de se observar a cobertura sináptica em relação aos neurônios, cabra anti-GFAP (1:100, Santa Cruz) e cabra anti-ezrina (1:200, Santa Cruz), ambos marcadores de astrócitos e tais proteínas são aumentadas com a maior reatividade dessas células, e coelho anti-Iba1 (1:1400, Wako), um marcador de microglia.

Em seqüência à primeira incubação, as lâminas foram lavadas em PB 0,01M, pH 7,4 e incubadas com os anticorpos secundários adequados: anti-coelho-CY-2, anti-cabra ou anti-rato-CY-3 (Jackson Lab, USA) por 45 minutos. Os espécimes foram lavados em PB 0,01M, pH 7,4 e montados com lamínula em glicerol/PB 0,01M (3:1). O material foi então observado e documentado utilizando-se sistema confocal (BioRad MRC-1024UV) acoplado a um microscópio invertido de fluorescência (Axiovert 100, Zeiss) utilizando-se os filtros para fluoresceína (CY-2, 488nm) e rodamina (CY-3, 568nm).

Foram capturadas três imagens representativas, com objetiva de 40x, de cada lado (lesado e não lesado) da coluna ventral da medula espinal para cada animal. Para quantificação utilizou-se o software IMAGEJ (versão 1.33u, National Institutes of Health,

USA). Para cada imagem, quantificou-se, de forma sistemática, a densidade integrada de pixels em seis áreas representativas ao redor dos grandes neurônios do núcleo motor lateral da medula espinal. Calculou-se a média aritmética para essas seis medidas. A partir da média da densidade integrada de pixels em cada lado da medula, foi calculada a razão lado lesado/não lesado para cada secção medular analisada. Como cada animal apresentava três secções, ou três imagens, da sua medula lombar, calculou-se, então, a média aritmética das razões para cada animal, e em seguida, a média para o grupo (n=5), sendo os resultados apresentados como média ± erro padrão (EP).

4.1.5) Hibridação in situ

A técnica de hibridação in situ permite além da observação da quantidade, a localização da expressão do RNAm de interesse, dado de extrema importância para o presente trabalho. Nessa técnica utilizou-se material congelado em Tissue-Tek conforme descrito para imunohistoquímica, porém, sem fixação prévia das medulas espinais. Dos blocos congelados com o material, foram obtidos secções transversais de 14 μm em criostato, coletadas em lâminas de vidro silanizadas e estocadas a -22ºC até a utilização.

As sondas complementares ao RNAm das proteínas GFAP (nucleotídeos 7863-7910, número de acesso X02801) e microgrobulina beta-2, componente essencial do complexo de histocompatibilidade principal (nucleotídeos 304-351, número de acesso X01838), foram marcadas em sua terminação 3´com 35S (Amersham; atividade específica de 7-10 x 108 cpm/μg) utilizando-se a enzima terminal deoxinucleotidil transferase (TdT) (Figura 5).

Após a marcação, as sondas quentes foram purificadas por filtração em uma coluna de sílica (GenEluteTM PCR DNA purification kit, Sigma) e hibridizadas às secções por 16 a 18 horas a 42ºC. A mistura de hibridação constituiu-se de formamida 50% (G.T. Baker Chemicals B W, Deventer, The Netherlands), SSC 4X (Tampão cloridrato de sódio-citrato de sódio, SSC 1X = NaCl 0,15 M e citrato de sódio 0,015M), solução de Denhardt 1X, N- laurosylsarcosina 1%, tampão fosfato 0,02M (pH 7,0), sulfato de dextran 10% (Pharmacia), 250 μg de RNAt de fungo (Sigma, St. Louis, MO), 500 μg/ml de DNA de esperma de salmão (Sigma) desnaturado por aquecimento e ditiotreitol 200mM (DTT; LKB, Bromma, Sweden). Após a hibridação, as secções foram lavadas 6 vezes em SSC 1X a 60ºC durante 15 min cada lavagem e, em seguida, desidratadas em etanol. Depois de secas em temperatura ambiente, as lâminas foram mergulhadas em emulsão fotográfica (NTB2; Kodak, Rochester, NY) e estocadas em caixas e isoladas sem qualquer penetração de luz. Após seis semanas em ambiente refrigerado a 4°C, as secções foram reveladas com revelador D-19 (Kodak), coradas com coloração de Nissl e montadas com lamínula. Nas secções controle, uma quantidade vinte vezes superior da sonda fria foi adicionada à mistura de hibridação.

Figura 5: Esquematização da técnica de hibridação in situ. Sondas, marcadas com isótopo radioativo,

complementar ao RNAm alvo e, à direita, uma vista panorâmica de um corte transversal na região lombar da medula espinal corada com corante de Nissl, em destaque (flecha maior em preto) marcação dos RNAs para microglubulina beta-2 no interior e nas circunjancencias dos neurônios motores que compõem o pool do nervo isquiático.

Em seguida as imagens foram documentadas (aumento final linear 400X) utilizando- se uma câmera digital conectada a um microscópio de luz. A análise quantitativa realizada utilizou o software Image Tool (versão 3.0 UTHSCSA, USA). Com este programa, foram contados os grãos cinza. As células cuja marcação foi cinco vezes superior ao fundo foram consideradas positivas. Neste sentido, três secções de cada lado da medula espinal por animal foram analisadas.

4.1.6) Western blotting

Para homogeinização tecidual foram utilizados segmentos de 3 mm da intumescência lombar não fixada, divididas em lados direito e esquerdo através da fissura mediana ventral. Aos espécimes foram adicionados 100 µl de tampão Ripa (150mM NaCl, 50mM Tris pH 8.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 0.5% Na-deoxicolato ácido, 0.1% SDS and 1% Triton X- 100) e todas as amostras foram homogeinizadas em sonicador durante 1 min. Os homogeinizados foram centrifugados a 10.000 g durante 10 min a -5°C, em centrífuga refrigerada (Bio-Spin-R, BioAgency). Os sobrenadantes foram coletados e estocados a - 22°C.

Nessas amostras, foi realizada a quantificação da concentração total de proteína por Bradfords em leitor de Elisa. Foram utilizadas 40 μg (GFAP) ou 100 μg (MHC I) de proteínas na proporção de 1:1 para eletroforese em gel de 10% de poliacrilamida e gel de empacotamento a 4%. As placas contendo os géis foram montadas em cuba vertical para eletroforese (Bio-Rad) contendo tampão constituído de TRIS 0,25 M, glicina 1,9 M e 1% de SDS, pH 8,7. A corrida foi sempre acompanhada por padrão de peso molecular (Precison Plus Protein Standards, Bio-Rad) e fonte de corrente contínua ajustada em 100 V.

Após a corrida foi feita eletrotransferência das proteínas dos géis para membranas de nitrocelulose (Hybond-ECL, Amersham Biosciences), utilizando-se tampão constituído de TRIS 0,25 mM, glicina 12 5mM e 20% de metanol, pH 8,3, durante 1 h com corrente elétrica de 400 mA. As membranas de nitrocelulose foram, então, bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado diluídos em tampão TBS-T (tampão TRIS, 0,2% tween 20) durante 45 ou 60 min e, posteriormente, incubadas com anticorpo primário overnight em temperatura de 4°C, diluições 1:1000 (coelho anti-GFAP, Dako) em solução de 0,1% de

leite em pó desnatado em TBS-T e 1:500 (clone ER-HR52, rato anti-MHC I, Península) em solução de 1% de leite em pó desnatado em TBS-T. Após esse período, as membranas foram lavadas 3x em tampão TBS-T e incubadas durante 1 h com anticorpo secundário conjugado HRP cabra anti-coelho IgG or Coelho anti-rato IgG (1:2500, Zymed Laboratories, San Francisco,USA) em TBS-T. Após outra série de lavagens, foi realizada a detecção das bandas imunoreativas através de quimiluminescência (luminol, Perkin Biotechnology). A intensidade das bandas foi determinada através de densitometria de pixel com o auxílio do software ImageJ (versão 1.33u, National Institutes of Health, USA).

4.1.7) Microscopia eletrônica de transmissão

Nesta técnica utilizou-se fixador contendo glutaraldeído (2%) e paraformaldeido (1%) em PB, pH 7,4.

Após a permanência das medulas em fixador por 12 horas em temperatura de 4°C, estas foram lavadas três vezes em PB 0,01M, pH 7,4 e seccionadas longitudinalmente, através de sua fissura mediana ventral. Os fragmentos colocados individualmente em frascos contendo PB foram pós-fixados, por um período de duas horas, em solução de tetróxido de ósmio a 1%, diluído em PB, pH 7,4.

Seguindo-se a pós-fixação, os fragmentos foram lavados em água destilada e desidratados em série crescente de álcool e acetona, sendo incluídos em resina (Epon, EMS). Os blocos foram desbastados e secções semifinas (0,5µm) obtidas e coradas com azul de toluidina 0,25% para a observação ao microscópio óptico. A seguir, após a identificação da coluna ventral da medula, os blocos foram retrimados para o isolamento da região contendo os motoneurônios a serem analisados. Em seguida, foram realizados cortes

ultrafinos com espessura de 50 nm (500Å; ultramicrótomo Leica Ultracut UCT). Estes cortes foram coletados em telas de cobre (“single slot grids” recobertos com formvar), e contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo. Os espécimes foram observados e documentados em microscópio eletrônico de transmissão (Leo 906, Zeiss), operando a 60KV.

4.1.8) Análise das secções ultrafinas

Neurônios com grandes corpos celulares (>35 μm de diâmetro), encontrados no grupo motor lateral da coluna ventral da medula foram identificados como motoneurônios alfa pela presença de pelo menos um terminal do tipo C (Conradi, 1969). Os neurônios identificados como axotomizados, baseado na ocorrência de modificações cromatolíticas no corpo celular, tiveram sua superfície digitalizada seqüencialmente em um aumento de 10.000x, empregando-se uma vídeo-câmera (Sony) conectada a um sistema computadorizado KS300 (Kontron – Zeiss). As imagens foram montadas seqüencialmente no software Corel Draw 12.0.

Os terminais sinápticos, em contato com o corpo celular dos motoneurônios, foram identificados (F, S e C, segundo Corandi, 1969) e quantificados por 100 μm de membrana, pela porcentagem de cobertura da membrana e pelo número de terminais pré-sinápticos parcialmente retraídos. Também foram medidas as distâncias, na superfície neuronal, entre terminais nervosos consecutivos. Foi analisado, dessa maneira, um total de 30 motoneurônios alfa (dois por animal, em três grupos de cinco animais: normal, axotomizado e axotomizado mais tratamento com IFN beta).

4.2) Procedimentos in vitro

4.2.1) Cultura purificada de astrócitos

Culturas purificadas de astrócitos foram estabelecidas através da dissociação do córtex cerebral (McCarty e De Vellis, 1980) de camundongos C57BL/6J neonatos (primeiro ou segundo dia pós-natal) obtidos no CEMIB/UNICAMP. O procedimento foi realizado com material cirúrgico estéril. Desta forma, procedeu-se com a dissecção e fragmentação do tecido, o qual foi lavado em PB (0,1M, pH 7,4, Nutricell, Brasil) e imerso em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) sem cálcio e magnésio (pH 7,7, Nutricell, Brasil). Prosseguiu-se com a tripsinização (70 μl de tripsina em 4 ml de PB por três minutos) e posterior adição de soro fetal bovino para bloqueio da ação enzimática. A solução resultante foi colocada sobre um coxim de BSA (bovine serum albunin, albumina bovina 4% em DMEM) e submetida à centrifugação (1.300 RPM por 10 minutos). O precipitado foi ressuspendido em meio de cultura para células gliais, previamente preparado e aquecido a 37°C. As células foram aplicadas em placa para cultura (Costar, USA) contendo 24 poços (300 µl em cada poço).

As placas com as culturas de astrócitos foram mantidas em incubadora sob temperatura de 37°C e atmosfera de 5% de CO2. Após 24 horas, deu-se início ao tratamento com IFN

beta nas dosagens de 100, 500 e 1000 UI de IFN beta/ml ou com Acetato de Glatirâmer com doses de 1,2, 2,5 e 5,0 μg/ml durante cinco dias consecutivos (Jiang et al., 1995; Abarca-Heidemann et al., 2002). Culturas não tratadas foram utilizadas como controle. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

4.2.2) Imunocitoquímica

Finalizado o período de tratamento, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% em DMEM. Após a fixação, as células foram lavadas em PB sem cálcio e magnésio (0,1M, pH 7,4, Nutricell, Brasil) e incubadas durante duas horas com anticorpo primário cabra anti-GFAP (1:100, Santa Cruz), cabra anti-ezrina (1:200, Santa Cruz) e camundongo anti-OX-18 (anticorpo anti-MHC I, 1:100, Serotec). Foram, então, novamente lavadas em PB estéril e incubadas durante 45 minutos com anticorpos secundários anti-cabra ou anti- camundongo conjugados com CY-3 (Jackson Lab., USA). Concluído o tempo de incubação, as células foram lavadas, sendo que nas células imunomarcadas com GFAP foi realizada citoquímica com DAPI (4' -6-diamidino-2-fenilindol) que identifica o núcleo celular ligando-se às moléculas de DNA, desse modo foi possível a quantificação do número de células bem como do acompanhamento do crescimento celular. Após finalização da técnica, as culturas foram mantidas em glicerol/PB 0,01M (3:1) para análise em microscópio confocal.

Para cada grupo (controles e dosagens experimentais) três culturas de células foram incubadas com cada anticorpo, num total de nove poços por grupo. A quantificação foi realizada de maneira similar ao procedimento in vivo, utilizando-se o software IMAGEJ (versão 1.33u, National Institutes of Health, USA). Assim, seis áreas representativas de cada cultura foram documentadas para quantificação da densidade integrada de pixels. Uma média aritmética foi calculada para cada cultura e, através da análise desses valores, realizaram-se as comparações entre os grupos.

4.3) Análise estatística

A análise estatística comparativa foi realizada através dos testes U de Mann Whitney e t de Student para dados não-paramétricos e paramétricos respectivamente, assumindo-se níveis de significância para p<0,05 (*), p<0,01 (**) e p<0,001 (***).