a. Impacts d’une sécheresse édaphique intense et prolongée
IV.15. A et B). Cinq disques (aire = 38mm²) de feuilles ont donc été prélevés sur
5 feuilles différences à T0.5.
- A T1 (1 jour après le marquage) et T2 (2 jours après le marquage), des échantillons foliaires ont été prélevés de la même manière qu’à T0.5. et sur les mêmes 5 feuilles.
- A T4 (4 jours après le marquage), le reste des 5 feuilles trouées a été prélevé. Une autre feuille a également été prélevée pour quantifier l’assimilation de 15N dans les protéines foliaires sur un sous échantillon des arbres marqués (6 arbres/traitement/ date).
Figure IV.15. Photographies des prélèvements foliaires réalisés suite à l’expérimentation de marquage sur une branche. A : Utilisation du poinçonneur afin de prélever un échantillon foliaire. B : Feuille trouée suite à l’utilisation du poinçonneur.
- A T7 (une semaine après le marquage), un nouveau prélèvement foliaire par poinçonnage a été effectué sur 5 nouvelles feuilles.
- Enfin, après 14 jours, l’ensemble du feuillage de la branche marquée ainsi que la branche portant les feuilles marquées ont été récoltés. La branche a été séparée par pousse annuelle. Des feuilles provenant du rameau apical de l’arbre ont été également échantillonnées afin de suivre le transport longue distance de l’azote.
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A chaque date d’échantillonnage, les échantillons ont été soigneusement lavés à l’eau distillée et immédiatement plongés dans l’azote liquide. La figure IV.16 ci-dessous résume le calendrier de l’expérimentation.
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Figure IV.16. Schéma récapitulatif de la stratégie expérimentale de notre marquage à l’azote 15.
4.3.4. Allocation du
15N à l’échelle arbre entier
De manière analogue au marquage 15N branche, nous avons distingué pour cette
expérimentation deux niveaux de sécheresse selon les valeurs de potentiels de base mesurées en Septembre 2015 au moment du marquage. Ainsi, 2 classes d’arbres ont été choisies dans les traitements secs en fonction de leur potentiel hydrique de base, de -0,5 à -1,5 MPa, classés en tant que secs modérés et une seconde classe avec des potentiels de base compris entre -2,5 MPa et -4 MPa classés en tant que secs sévères.
Et rameaux d’arbres non marqués
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Une solution aqueuse d’urée enrichie en 15N (urée-15N2, 10,4 atom% (5 g/L)) a été appliquée sur le feuillage au moyen d’un pulvérisateur (Figure IV.17.A). Afin d’éviter toute contamination du sol et des arbres avoisinants suite au marquage, des sacs plastiques transparents ont été installés sur toute la couronne et attachés au collet de l’arbre. L’ensemble des feuilles a reçu, sur la face inférieure et supérieure, de l’urée marquée en partant des étages foliaires inférieurs et en remontant au fur et à mesure jusqu’à la cime de l’arbre. Le sac transparent a ensuite été fermé à son extrémité (Figure IV.17.B et C) et afin d’éviter toute condensation à l’intérieur dû à la transpiration foliaire, le sac a été troué à plusieurs endroits. Le sac transparent a été enlevé le lendemain matin en début de matinée.
Figure IV.17. Photographies de l’expérimentation de marquage 15N-arbre entier. A :
pulvérisation de l’urée marquée sur les feuilles. B et C : Sac en plastique transparent mis en place après le marquage, percé de trous et enlevé le matin suivant le marquage.
Suite à ce marquage, trois séries d’abattages ont eu lieu :
- en Octobre 2015, un mois après le marquage, au moment théorique du recyclage de l’azote foliaire vers les parties pérennes de l’arbre, afin de déterminer si notre marquage foliaire et la résorption foliaire étaient effectifs.
- en Février 2016, 5 mois après le marquage pour suivre la remobilisation théorique de l’azote des feuilles vers les organes puits que sont les organes pérennes de l’arbre (branches, tronc, racines).
- en Juin 2016, 9 mois après le marquage, une fois l’expansion foliaire terminée lorsque la remobilisation des réserves azotées vers les organes puits que sont principalement les feuilles à cette date est achevée (Figure IV.18).
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Figure IV.18. Frise chronologique des abattages pour la répartition 15N arbre entier.
Les effectifs des abattages sont donnés ci-dessous (Tableau IV.3).
Tableau IV.3. Tableau des effectifs des arbres abattus pour suivre la répartition 15N arbre
entier.
Octobre 2015 Février 2016 Juin 2016
C 2 6 6
D 2 6 6
MD 2 3 3
SD 2 3 3
Les compartiments sélectionnés pour l’analyse isotopique sont :
- L’ensemble du feuillage en Février (constitué par la litière récoltée au moyen d’un filet) et du feuillage de l’année en Juin.
- L’ensemble des branches.
- Le tronc selon la hauteur (base, à mi-hauteur, au sommet).
- Le compartiment racinaire découpé selon le diamètre de manière analogue à la partie NSC arbre entier.
Afin d’éviter toute contamination isotopique entre échantillons lors de l’abattage, chaque instrument utilisé a été soigneusement lavé entre chaque découpe.
Des arbres supplémentaires non marqués (n= 10, arbres communs avec ceux utilisés pour l’analyse de la répartition des NSC à l’échelle arbre entier) ont été également abattus pour déterminer l’abondance naturelle en 15N des différents organes de l’arbre.
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4.4. Phase de préparation des échantillons pour les analyses
Tous les échantillons congelés dans l’azote liquide ont été lyophilisés (déshydratation à froid par sublimation de la glace sous vide) sur une période de 5 jours. (Dura-Top, Dura-dry, FTS Systems, Stone Ridge, NY, USA) puis ont été ensuite stockés au sec à l’abri de la lumière. Enfin, ils ont été mis à l’étuve à 45°C pendant 48h avant d’être pesés afin d’avoir la matière sèche (MS, mg) de chaque échantillon. A noter que les échantillons enrichis isotopiquement et ceux non marqués ont été traités indépendamment (lyophilisés, pesés, broyés et stockés séparément) afin d’éviter toute contamination des échantillons non marqués.
Les échantillons ont été broyés à l’aide d’un broyeur à bille ou à anneaux (Figure IV.19) selon le volume (CEPI SODEMI CB2200, Cergy, France). Une fois broyés, les échantillons ont été stockés en pilulier ou en eppendorf à l’abri de la lumière. Une étape supplémentaire de lavage à l’éthanol du matériel de broyage (bol, bille, spatule) a été effectuée sur les échantillons enrichis afin d’éviter toutes contamination entre les échantillons.
Figure IV.19. Photographie du broyeur à anneau (A) et à billes (B). Crédit photo : L. Yahiaoui.
B
A
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