Dispositions applicables aux expositions sur actions

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3 Discussão

Este trabalho foi elaborado com base em dois artigos, desenvolvidos em projetos independentes: o primeiro envolvendo a busca por marcadores moleculares para diferenciar lesões cervicais de alto grau a partir do exame de citologia oncológica (CO) e o segundo explorando a composição lipídica do caviar para caracterizá-lo em função de processos de conservação aplicados.

O projeto envolvendo a caracterização de material proveniente do exame de CO teve início com a visita de um grupo de médicos patologistas ao laboratório ThoMSon em 2012, visando conhecer e se aproximar do que para eles era uma nova plataforma analítica, chamada MS. Entre as discussões realizadas com esses patologistas, percebeu-se a demanda por uma técnica mais eficaz de rastreamento para lesões cervicais. A prevalência de alterações citológicas no colo do útero detectadas a partir do exame de CO é de aproximadamente 5%, sendo que dessas alterações, apenas a décima parte (cerca de 0,5% do total) refere-se a HSIL(128). Ou seja, para encontrar uma lâmina HSIL, um patologista deve ler cerca de 200 lâminas, o que corresponde a dois dias de trabalho(129). Além disso, a sensibilidade reportada para o exame de CO pode chegar a 50%(130), o que se aproxima da probabilidade de acertar cara ou coroa ao jogar uma moeda, ou seja, é uma sensibilidade muito baixa para rastrear o quarto principal tipo de câncer a acometer a população feminina no mundo(67).

O exame de CO é amplamente utilizado como um método de detecção de lesões cervicais malignas ou pré-malignas, além de permitir a avaliação do trato genital como um todo, sendo esta a principal forma de prevenção do câncer de colo do útero. Para isso, células do colo uterino são coletadas pelo uso de uma escova, sendo retiradas da região externa do colo do útero (ectocérvix) com a espátula de Ayre, e interna (endocérvix) com escova.

A partir da coleta, as células aderidas à escova podem ser diretamente depositadas sobre uma lâmina de vidro através de um esfregaço fino e subsequente fixação com etanol, constituindo assim a coleta convencional(131). Outra possibilidade é inserir a escova em um líquido cuja função é fixar e preservar as células, constituindo a citologia de base líquida. Esse líquido é então encaminhado a um laboratório especializado que, por meio de uma série de processos automatizados, realiza a filtragem e deposição das células, gerando uma lâmina com fundo mais limpo e minimizando a superposição de células e o obscurecimento por elementos indesejáveis(132). A citologia em base líquida vem substituindo a citologia convencional em todo o mundo, possuindo a vantagem de ter o material da coleta disponível para análise em outras plataformas como, por exemplo, a detecção do HPV por meio de marcadores moleculares

de DNA. No Brasil, no entanto, a citologia convencional é o único exame fornecido pelo Sistema Único de Saúde (SUS) para compor o programa de prevenção de câncer cervical.

Dessa forma, para realização deste trabalho, optou-se primeiramente por procurar um laboratório diagnóstico particular para obtenção de amostras coletadas em base líquida. Foi então estabelecida uma parceria com o Laboratório Salomão Zoppi (SZD), na cidade de São Paulo, que possibilitou o uso do material sobressalente das amostras de CO em base líquida analisadas por esse laboratório. Tal parceria, devidamente aprovada pelo conselho de ética (CEP/CONEP, parecer 232.883 de 26/03/2013, anexo 2), tinha a vantagem de ser dispensada do uso do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), por fazer uso de amostras caracterizadas não identificáveis em relação aos dados da paciente.

Estudos iniciais com o conservante utilizado para as amostras de CO (ThinPrep®, Hologic) vindas do SZD revelaram que o mesmo era composto por grande quantidade de polímeros. Inicialmente, acreditava-se que a presença de polímeros não impediria a análise por MS e a busca por íons classificatórios para os diferentes tipos de amostra, uma vez que íons interferentes poderiam ser eliminados através do tratamento estatístico de dados. No entanto, somou-se a essa dificuldade o baixo número de células nas amostras, que se mostrou limitante na geração de um sinal satisfatório para análise por MS. Para superar tais dificuldades várias estratégias foram testadas: o uso de diferentes fontes de ionização como MALDI, ESI e APCI (atmospheric pressure chemical ionization), a análise por injeção direta, o uso de separação por cromatografia líquida, diferentes metodologias de preparo e extração da amostra, diferentes metodologias de tratamento de dados. No entanto, não foi possível atingir a separação dos grupos de estudo propostos sendo este fato principalmente atribuído à presença de contaminantes poliméricos na amostra.

A fim de gerar uma amostra livre de contaminantes, procurou-se uma nova parceria, num local onde pudesse ser estabelecida uma coleta em base líquida num conservante otimizado, compatível com a plataforma de MS. Assim, foi estabelecida a parceria com o hospital da mulher “Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti” – CAISM-UNICAMP, conforme descrito no manuscrito apresentado no item 2.1. Embora esse hospital não trabalhasse com a citologia em base líquida, foi permitida a utilização desta metodologia, desde que os gastos não fossem absorvidos pelo hospital. Dessa forma, o projeto foi delineado para coletar amostras de pacientes com lesão epitelial de alto grau (HSIL) e com citologia negativa, de acordo com a aprovação do comitê de ética (CEP/CONEP, parecer 1.181.203 de 25/08/2015, anexo 3), mediante assinatura do TLCE aplicado a cada paciente na ocasião da coleta (anexo 4).

A nova parceria com o CAISM trouxe como vantagem a possibilidade de somar o diagnóstico por histologia de pacientes com lesões HSIL ao resultado da citologia de CO desses pacientes, uma vez que mulheres nessa condição são submetidas à excisão do colo do útero, sendo realizada análise histológica do tecido retirado. A análise histológica é considerada a técnica ouro para caracterização de HSIL(70).

Além da análise da citologia para todos as amostras e da histologia para as amostras HSIL, viu-se a necessidade de assegurar que um resultado negativo para células atípicas não fosse decorrente da baixa sensibilidade da análise do patologista. A sensibilidade da CO para detecção de HSIL pode chegar a 50%, com taxas de falso-negativo variando de 20-40%(130, 132). Para minimizar esse problema, optou-se por realizar a detecção do DNA do HPV em todas as amostras, podendo assim assegurar a condição das amostras controle (citologia negativa e HPV negativo).

A inclusão de mais este teste diagnóstico possibilitou a comparação entre indivíduos com e sem lesões cervicais, portadores de HPV, podendo relacionar biomarcadores ao fenótipo das pacientes. Essa informação é bastante relevante já que a grande maioria (~75%) das mulheres infectadas pelo HPV de alto risco (hr-HPV, high risk-HPV) apresentam citologia normal, não havendo forma de diferenciar quais entre elas irão desenvolver câncer(70). De fato, a comparação entre esses dois grupos mostrou-se bastante promissora, conforme a Figura 1 do manuscrito apresentado no item 2.1, onde observou-se que os biomarcardores propostos foram capazes de diferenciar indivíduos HPV-positivo portadores ou não de lesão HSIL.

Muitos países optaram por realizar seu programa de triagem e prevenção do câncer cervical realizando a detecção de hr-HPV em todas as mulheres na etapa de triagem primária e a análise por citologia apenas para mulheres portadoras de HPV, visando a detecção de HSIL e outras células atípicas, já que a citologia aplicada com conhecimento prévio da presença/ausência de HPV tem sensibilidade aumentada(70). Um teste como o proposto nesse trabalho teria, portanto, uma função auxiliar à citologia, na triagem de mulheres HPV-positivas, visando detectar quem, entre elas, deveria ser encaminhada para colposcopia (avaliação cervical) ou tratamento (excisão).

Para definição do procedimento de coleta, meio de conservação e método de preparo das amostras, foram realizados testes com um conjunto piloto de amostras. Em relação ao procedimento de coleta, foi importante assegurar que qualquer manipulação ou exame de toque no colo uterino, precedendo a coleta, não fosse realizado com uso de lubrificante (vaselina, por exemplo). O uso do preservativo para envolver o espéculo (instrumento utilizado para abrir o canal vaginal) não interferiu no conteúdo da amostra, já que o preservativo não entra em contato

com a região da coleta. Para pacientes a serem submetidos a colposcopia, a coleta necessariamente deveria ser feita antes da aplicação de ácido acético ou lugol, a fim de garantir a integridade das células coletadas. Em relação ao método de coleta, a escolha da escova cervical Cytobrush (Surepath®, BD) com formato diferenciado, permitiu a coleta simultânea da região da endocérvix e da ectocérvix, dispensando o uso da espátula de Ayre(131). O meio de conservação utilizado mostrou-se satisfatório desde o primeiro momento, sendo compatível com as demais etapas diagnósticas. No entanto, mostrou-se imprescindível o uso de lâminas silanizadas para deposição das células, pois houve perda significativa de material celular e prejuízo no diagnóstico do citologista quando lâminas comuns de vidro foram utilizadas, provavelmente devido ao processo de coloração das lâminas para análise ao microscópio.

Embora tenha se utilizado um conservante customizado, o mesmo mostrou-se compatível com as demais metodologias aplicadas (citologia e teste de DNA-HPV). Acredita-se que, após a determinação dos íons diagnósticos para classificação das amostras, o método possa ser otimizado de forma a maximizar sua sensibilidade e diminuir o tempo de corrida, tornando-se viável mesmo na presença de contaminantes como os detectados em meios de coleta comerciais (ThinPrep® _{da Hologic ou Surepath® da BD). Do ponto de vista logístico, seria mais} interessante para a rotina laboratorial incluir uma nova técnica sem alterar o fluxo e qualidade das técnicas existentes. Uma perspectiva lançada pelo presente trabalho seria a investigação desses biomarcadores em amostras coletadas em conservantes comerciais, num coorte maior de pacientes, visando a validação clínica dos resultados.

Em relação ao modelo estatístico utilizado para tratamento e predição dos dados, o método de SVM foi escolhido por ter as vantagens de permitir a classificação de amostras desconhecidas, não ser susceptível à distribuição das amostras e ser mais robusto frente a outliers do que o método PLS-DA, comumente empregado em estudos metabolômicos(41). SVM é um método não paramétrico de aprendizagem automática (machine learning) que mapeia os dados num espaço de alta dimensionalidade, separando-os em subregiões ou grupos distintos. A separação é definida classificando apenas um pequeno grupo de amostras de cada vez, estabelecendo-se assim vetores suportes (suport vectors) que vão sendo mais ajustados ou afrouxados com a análise de novos subgrupos de amostras. Para que não sofra um super-ajuste, algumas amostras são sempre classificadas erroneamente e depois reclassificadas, para avaliar a performance desses vetores suportes(101).

De posse das amostras caracterizadas, muitos testes foram realizados e não geraram publicações ou resultados satisfatórios, porém serviram de base para o aprendizado que resultou no trabalho apresentado nessa tese e outros também em vias de publicação. Uma das abordagens

testadas constituiu-se na análise dos extratos orgânicos das amostras a partir da técnica de MALDI-MS, visando, principalmente, a detecção de lipídios. Outra tentativa foi a análise direta da lâmina microscópica contendo o material celular fixado através da técnica de espectrometria de massas ambiente intitulada DESI-MS (desorption electrospray ionization-MS). Ambas abordagens obtiveram resultados inferiores aos apresentados aqui, sendo, portanto, suprimidas desse trabalho. Extratos aquosos das amostras também foram coletados e enviados para caracterização do conteúdo proteico, em parceria com o Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas (LBQP) da Universidade de Brasília (UnB), por meio da professora Dra. Aline Maria Araújo Martins. Os resultados dessa análise ainda estão em fase de tratamento de dados. Por ser dotada de figuras de mérito como alta sensibilidade e especificidade, a MS tem presença crescente em laboratórios clínicos. Vários tipos de espectrômetros de massas vêm sendo utilizados para finalidades clínicas e de diagnóstico pelo mundo todo e, como resultado disso, melhoras significativas na performance dos exames vêm sendo alcançadas, como nas áreas de endocrinologia, toxicologia, triagem neonatal, entre outras(133). No entanto, ainda há na clínica uma demanda por novas tecnologias que possibilitem o diagnóstico rápido e confiável, baseando-se em assinaturas moleculares, ou biomarcadores. Tais tecnologias tem como objetivo complementar o trabalho de patologistas e citologistas, que avaliam a morfologia da célula, sua estrutura, organização e interação com seu micro-ambiente, a fim de formular um diagnóstico para uma vasta gama de doenças e principalmente para o câncer. Com o advento da genômica e da proteômica, muitos métodos imuno-histoquímicos foram desenvolvidos para auxiliar o trabalho de patologistas e os avanços de MS vem nesse mesmo sentido, de forma a embasar o diagnóstico clínico de maneira exata e inequívoca, dando menor margem para subjetividade inerente a este tipo de análise(54). Um estudo metabolômico, como o apresentado aqui, é um dos exemplos onde a avaliação das características resultantes do genoma e proteoma pode agregar valor ao diagnóstico e monitoramento de uma dada doença, avançando assim no entendimento das diferenças entre um estado de saúde sadio e doente.

A segunda publicação, apresentada no item 2.2, versa sobre técnicas de alto rendimento para caracterização lipidômica de caviar. O conteúdo lipídico dos alimentos exerce um papel crucial em sua degradação. A robustez dos alimentos frente ao processo de industrialização, a degradação dos alimentos por técnicas de armazenagem, sua rotulagem inadequada em relação a autenticidade e origem, entre outros tópicos, são algumas das questões que podem ser resolvidas através da análise de lipídios em alimentos(59). Embora possa parecer um tema distante da primeira publicação, mostrada no item 2.1, a segunda publicação também traz uma abordagem metabolômica, representada por seu subconjunto de lipídios(134). Matrizes

alimentícias são tão complexas quanto matrizes biológicas e exigem técnicas de extração e preparo de amostra, bem como análise de dados que exigem muitas das estratégias e conhecimentos gerados por uma pesquisa metabolômica clínica(56).

O trabalho sobre o caviar foi iniciado com a visita do pesquisador russo Albert T. Lebedev em 2013, do Departamento de Química Orgânica da Universidade Estadual de Moscou, trazendo consigo amostras de caviar de diferentes origens, no intuito de diferenciá-las quimicamente a fim de certificar sua qualidade e origem. Para a realização desse trabalho, as amostras foram analisadas em diferentes plataformas de MS, visando obter uma caracterização abrangente da mesma.

Merece especial destaque nessa publicação a conformidade entre os dados obtidos pelas diferentes técnicas de ionização utilizadas (MALDI-MS, TI-EASI-MS e ESI-MS), utilizando diferentes analisadores e que possibilitaram uma caracterização abrangente do conteúdo lipídico das amostras de caviar. Da forma como o experimento foi desenhado, a performance das diferentes fontes de ionização não pode ser comparada em relação à sensibilidade ou faixa dinâmica. No entanto, ambas as fontes de MALDI e EASI foram capazes de responder à pergunta científica em questão: a diferenciação do processamento e condições de estocagem de caviar.

Particularmente, a impressão térmica utilizada como técnica de extração para análise por EASI-MS e ESI-MS mostrou-se adaptável ao uso em técnicas de ionização não ambiente e possibilitou a análise do conteúdo lipídico sem perda de informação, de forma simples e com mínimo uso de solvente, mostrando-se potencialmente interessante para evitar o uso de etapas laboriosas de preparo de amostra. Ademais, a confirmação de que não são formados produtos de oxidação durante o aquecimento da amostra fomenta a adequação desta técnica (TI) para extração de lipídios.

A técnica de TI-EASI-MS já havia sido utilizada para diferenciar produtos cárneos de diferentes espécies, como frango, porco, vaca, peixes, entre outros(135) e era questionável se diferenças mais sutis, como aquelas decorrentes do processamento industrial das amostras, poderiam ser percebidas utilizando-se esta técnica. O êxito obtido na diferenciação dessas amostras de caviar impulsionou o desenvolvimento de outros trabalhos no grupo, incluindo a escrita de um mini-review no periódico Analyst (59). Exemplo de pesquisa que também se baseou nesse trabalho foi o estudo da autenticidade e rastreabilidade de presuntos curados de cinco tipos (Cebo, Recebo, Bellota, Serrano e Parma) a partir da análise de seus perfis de ácidos graxos, diglicerídeos e triglicerídeos obtidos por TI-EASI-MS (136). Outro trabalho, ainda em

andamento, visa encontrar perfis lipídicos característicos à diferentes dietas de peixes de uma mesma espécie.

Em relação à caracterização dos íons através da medida de sua m/z exata utilizando o equipamento de FT-ICR-MS (Fourier transform ion cyclotron resonance), é interessante notar que ambas as plataformas utilizadas (MALDI-MS e EASI-MS) não forneciam uma alternativa para realizar esta caracterização. EASI-MS foi implementado em um equipamento mono- quadrupolar de resolução unitária, não sendo possível realizar estudos de fragmentação. O equipamento de MALDI-MS, embora possua analisadores sequenciais compatíveis com estudo de fragmentação (TOF/TOF), possui janela de isolamento de íon precursor de 4 a 6 Da, não sendo suficiente para isolar íons de lipídios sem a interferência de ions de m/z vizinha.

Embora a modernização das técnicas analíticas também tenha impactado na indústria alimentícia, grande parte da caracterização de conteúdo lipídico é feita através de ensaios físico- químicos e determinações através de cromatografia gasosa precedida por extração, hidrólise e esterificação do conteúdo graxo sendo, portanto, etapas bastante laboriosas(135). A demonstração de uma alternativa em MS relativamente simples - o uso de um detector monoquadrupolar e uma fonte de ionização ambiente, feita em laboratório - demonstram que é possível tornar esta técnica mais acessível, sem descaracterizar seu grande poder analítico, tendo em vista a obtenção de dados sobre tipificação e controle de qualidade através de assinaturas moleculares.

4 Conclusão

Nesse trabalho foram apresentadas diversas plataformas de MS e algumas abordagens de tratamento de dados possíveis de serem utilizados em estudos metabolômicos de materiais biológicos, com fins diagnósticos ou de tipificação. Tais abordagens são bastante amplas e podem ser aplicadas, de forma semelhante, a áreas tão distintas como clínica e de alimentos, evidenciando a transdisciplinaridade da MS.

No âmbito clínico, a análise do material proveniente do exame de CO mostrou-se bastante promissora, através da técnica de LC-MS. O fato de se ter realizado com êxito a caracterização das amostras por citologia, mostra que o método empregado para a coleta das amostras não corrompeu seu conteúdo, possibilitando a montagem das lâminas e avaliação convencional das amostras pelo patologista. Da mesma forma, para a detecção do HPV por marcadores moleculares de DNA, a amostra mostrou-se totalmente compatível, permitindo agregar esse diagnóstico ao conjunto de dados das amostras, o que enriqueceu a discussão à cerca das diferenças metabolômicas atribuídas ao fenótipo e ao genótipo das pacientes. O planejamento do trabalho e dos experimentos permitiu que uma mesma amostra fosse analisada por várias plataformas diferentes em MS, somando os resultados e possibilitando a escolha das melhores ferramentas analíticas, capazes de discriminar os grupos de estudo. Um único método de extração permitiu tanto a caracterização do perfil metabolômico por diferentes técnicas, como a análise do perfil protéico (em andamento). O método de LC-MS desenvolvido, embora longo (25 minutos) mostrou-se capaz de classificar inequivocamente as amostras analisadas através do algorítimo de SVM, apontando os íons marcadores para tal discriminação que já haviam sido reportados em pesquisas com câncer colo-retal, evidenciando a significância dos achados.

Com as crescentes aplicações de MS na área clínica, é importante que trabalhos futuros possam unificar e validar as abordagens já desenvolvidas, de forma a torná-las robustas para aplicação em rotina clínica e não mantê-la apenas no âmbito acadêmico. É imprescindível que haja interação entre os profissionais da área médica e especialistas em metabolômica para que entraves diagnósticos possam ser corretamente abordados, além do esforço concomitante na área de planejamento estatístico e análise de dados, visando a interpretação e classificação correta dos resultados obtidos. Além disso, o mercado de MS destinado a aplicações clínicas teve crescimento de 11% em vendas em 2016, demonstrando que essa vertente (MS aplicada à clínica) deve se consolidar cada vez mais e que os profissionais dessa área devem considerar se aprofundar em pesquisa translacional. Dessa forma, é presumível que aumentem as pesquisas