DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX

Cette section du chapitre « Matériels et Méthodes » décrit les différentes expériences menées au cours de ces travaux de thèse. Dans un premier temps, l’abondance et l’expression des gènes arsB, ACR3 et aioA ont été étudiées dans des systèmes simplifiés tels que des cultures d’enrichissement en présence des ETM d’intérêt (As et Sb). Progressivement, les dispositifs expérimentaux ont été mis en place dans le but de complexifier les systèmes d’étude comme par exemple l’expérience en batch dans du sable et, pour finir, les microcosmes de sols provenant du site essentiellement pollué à l’arsenic (Auzon). Cette dernière expérience permet ainsi de se rapprocher des conditions environnementales.

II.1. CULTURE EN MILIEU LIQUIDE

II.1.1.

Les échantillons de sol de Neuves-Maisons, tamisés à 2 mm ont été mis en suspension dans 30 ml de tampon salin (0,85 % NaCl) avec 10 g de billes de 2 mm de diamètre, puis homogénéisés par agitation à température ambiante, pendant une heure. Ensuite, les tubes sont immobilisés afin que les grosses particules sédimentent. Un volume de 10 ml de solution « Nycodenz », d’une densité de 1,3 g / ml (8 g de Nycodenz dans 10 ml d’eau ultrapure), est placé précautionneusement sous 20 ml de suspension de sol dans un tube à centrifuger de 50 ml en polycarbonate (Nalgene). Une centrifugation (Beckman JS 7,5) à 7500 rpm pendant 1h à 10°C permet de séparer les bactéries des particules de sol. Les cellules bactériennes, flottant au sommet de la solution de Nycodenz, sont récupérées avec une pipette. Le Nycodenz est éliminé par dilution de la suspension dans du tampon salin (0,85 % NaCl) avant une centrifugation à 4000 g pendant 20 min. Le culot bactérien est suspendu dans 10 ml de tampon salin. La densité de cellules dans la suspension est déterminée directement par comptage au microscope à l’aide d’une cellule de Thoma.

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II.1.2.

II.1.2.1. Dans un milieu nutritif

Les bactéries extraites par gradient de Nycodenz (décrit dans ce chapitre § 1.1) à partir de quatre fois 5g du sol de Neuves-Maisons ont été ensemencées à raison de 1,3x105 bactéries / ml dans 30 ml de milieu nutritif Luria Bertani (LB : Bactotryptone 10 g/l, Yeast Extract 5 g/l, NaCl 10 g/l) en présence de 0,66 mM d’arsénite de sodium (AsNaO2), de 12,5 mM d’arséniate de sodium (Na2HAsO4.7H2O) et d’un mélange de ces deux formes à ces concentrations. Ces tubes de 50 ml ont été incubés à 24°C, à l’obscurité, et sous une agitation de 150 rpm. Les prélèvements ont été effectués après 2 jours, 4 jours et 7 jours d’incubation. Un suivi de la croissance par mesure de la DO à 600 nm a été réalisé pour chacun de ces temps.

II.1.2.2. Dans un milieu minimum

Les bactéries extraites par gradient de Nycodenz (décrit dans ce chapitre § 1.1) à partir de 6 fois 10g du sol de Neuves-Maisons ont été ensemencées dans des erlenmeyers stériles de 250 ml à raison d’environ 5,9x105 bactéries / ml dans 35 ml de milieu Bushnell Haas (MgSO4 0,2 g, CaCl2 0,02 g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 1 g, NH4NO3 1 g, FeCl3 0,05 g) contenant 0,4 % de glucose et 150 µg.ml-1 de l’anti-fongique cycloheximide additionné ou non de 10 µM, 100 µM, 1 mM ou 10 mM d’arsénite de sodium (AsNaO2). Les erlenmeyers ont été incubés à 24°C, à l’obscurité, et sous une agitation de 150 rpm. Les prélèvements ont été effectués après 2 j, 3 j, 5 j, et 7 j d’incubation. Cette expérience a été réalisée avec trois réplicats. Un suivi de la croissance par mesure de la DO à 600 nm a été réalisé pour chacun de ces temps ainsi qu’un dosage de l’As(V) par chromatographie ionique et de l’arsenic total par ICP-OES.

II.2. INCUBATIONS DANS DU SABLE STERILE

L’extraction des bactéries par Nycodenz a été faite comme décrit dans le point II.1.1. de ce chapitre, afin d’obtenir dans 6 ml de suspension saline, une concentration voisine de 108

bactéries/ml. Du sable de quartz stérile (120 g, tamisé à 2 mm) a été placé dans des flacons de 250 ml. Les bactéries ont été inoculées à raison de 1,67.105 bactéries/g de sable en présence :

- d’exsudats racinaires artificiels

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- d’exsudats racinaires artificiels et d’arsenic (0,66 mM d’arsénite de sodium AsNaO2

et 12,5 mM d’arséniate de sodium Na2HAsO4.7H2O)

Un témoin sans source de carbone a également été suivi. L’ensemble de ces conditions a été réalisé en trois réplicats. Cette expérience a été réalisée en collaboration avec Aurélie Cébron du LIMOS donc les conditions avec le phénanthrène ne seront pas détaillées dans ce manuscrit.

Les exsudats racinaires artificiels (ERA) ont été préparés selon Griffiths et al. (1999) et ils contiennent du fructose (20 mM), glucose (20 mM), sucrose (20 mM), succinate (10 mM), malate (10 mM), arginine (5 mM), serine (5 mM), et cysteine (5 mM). La quantité de carbone apportée dans chacun des flacons, mélangée au milieu BH (§ II.1.2.2.), correspond à 1.16 g C.kg-1 de sable. Le volume de solution d’ERA et d’ERA + As était de 18,72 ml afin d’atteindre 80 % de la capacité de rétention en eau du sable.

Les flacons ont été scellés hermétiquement, placés à 24°C à l’obscurité et les échantillons bactériens ont été récupérés au bout de 6 jours.

II.3. MICROCOSMES DE SOLS

II.3.1.

Des échantillons de 25 g des sols 4, 6, 9 et 10 du site d’Auzon (Chapitre I.I du M&M - tableau 2) à 80% d’humidité ont été placés dans des flacons en verre stériles de 250 ml (avec bouchon) puis incubés à 24°C pendant 48 h et à l’obscurité. Les prélèvements ont été effectués après 48 h. Cette expérience a été réalisée avec trois réplicats par traitement. C’est une expérience indépendante de l’expérience décrite dans le paragraphe suivant.

II.3.2.

Des échantillons de 25 g des sols 2 et 9 du site d’Auzon à 80% de leurs capacités de rétention en eau ont été placés dans des flacons en verre stériles de 250 ml (avec bouchon). Dans une première modalité, les échantillons de sol ont été additionnés d’une source de carbone (citrate C6H8O7, 0,5 mg C/g de sol sec) et d’azote (nitrate d’ammonium NH4NO3, 0,04 mg N/g de sol sec) afin de stimuler l’activité de la communauté microbienne.

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Les microcosmes de sols (réalisés avec trois réplicats) ont été incubés à 24°C pendant 15 jours, à l’obscurité et ils ont été sacrifiés donc récupérés après 1 jour, 2 jours, 4 jours et 12 jours. La libération du CO2 a été mesurée chaque jour (BINOS 1004 Gas Analyser) et après chaque mesure, les flacons ont été aérés 10 min sous hotte.