Discussion sur la survie des macrophages dans l’athérosclérose murine

L’athérosclérose est à l’origine considérée comme une maladie du métabolisme lipidique où le facteur de risque majeur est une hypercholestérolémie associée à de fort taux de LDL. Les avancées scientifiques des dernières années sur les mécanismes d’initiation et de progression de la pathologie impliquent principalement le système immunitaire définissant ainsi l’athérosclérose comme une maladie inflammatoire chronique associée à des dyslipidémies. Initialement, le système immunitaire inné était considéré comme athérogène puisque les cellules qui le composent sont retrouvées au sein de lésions sous forme de cellules spumeuses ou bien de corps apoptotiques voir nécrotiques.

Aujourd’hui, grâce à une meilleure caractérisation des différentes sous populations impliquées, cette notion est revue.

En effet, dans notre laboratoire nous montrons que la modification de la sensibilité des cellules du système immunitaire inné face à l’apoptose peut avoir des répercutions protectrices ou athérogènes sur la maladie (annexe 2) (annexe 3) 44. Précédemment, nous

montrons que la survie des macrophages est associée à une réduction du développement des lésions 44. Mes travaux explorent dans des souris hypercholestérolémiques LDLrKO ou

127 ApoeKO, les mécanismes sous-jacents à la réduction de plaques préétablies lorsque les

macrophages sont génétiquement modifiés pour résister à l’apoptose.

a. Impact thérapeutique sur des lésions préétablies.

Après l’observation d’une protection contre le développement de plaques d’athérome avancées dans des souris ApoeKO possédant des macrophages résistants à l’apoptose, nous

avons voulu déterminer le potentiel thérapeutique de cette résistance sur des plaques préétablies puisque l’athérosclérose est une maladie évolutive qui n’aboutit aux complications connues qu’après plusieurs décennies d’évolution infra-cliniques.

Ainsi, mes travaux sont réalisés sur des souris hypercholestérolémiques soit LDLrKO soit

ApoeKO. J’ai laissé se développer les plaques dans ces animaux pour ensuite les irradier puis

les transplanter avec de la moelle osseuse de souris donneuses présentant une survie des macrophages (Mø-hBcl2 C57BL/6 ou Mø-hBcl2 ApoeKO) ou bien de leur contrôles associées

(C57BL/6 ou ApoeKO). Après une période de repeuplement cellulaire, les souris ont été

sacrifiées pour analyses.

On retrouve une diminution de la taille des lésions au niveau du sinus aortique lorsque les souris sont transplantées avec de la moelle osseuse Mø-hBcl2 dans les 2 fonds hypercholestérolémiques différents. La survie du macrophage, en plus d’avoir un effet protecteur sur le développement des plaques, peut donc avoir un effet thérapeutique sur des plaques préexistantes ouvrant la voie vers de nouvelles cibles pour le traitement de cette pathologie. Cependant, le contenu macrophagique ainsi que la stabilité des lésions n’ont pour le moment pas été évalués et feront l’objet d’analyses ultérieures.

Le facteur de risque majeur de l’athérosclérose étant l’hypercholestérolémie, nous avons dosé les taux plasmatiques de cholestérol total et libre dans nos animaux. On observe une association entre la réduction de la taille des plaques d’athérome et une diminution des

128 niveaux circulant de cholestérol. Ainsi, la survie des macrophages face à la mort cellulaire permet de réduire le risque majeur de la maladie. L’analyse des profils lipoprotéiques par FPLC sera réalisée prochainement afin de déterminer si toutes les fractions lipidiques sont réduites ou bien si seules les LDL qui sont pro-athérogènes sont touchées par cette réduction.

b. Effet de l’expression de la protéine hBcl2 sur le nombre de macrophages.

Dans notre laboratoire nous avons précédemment montré que dans ce modèle, l’expression de la protéine hBcl2 était retrouvée dans les cellules CD68 positives correspondant aux macrophages péritonéaux et spléniques. Afin de mieux caractériser l’effet de cette expression sur la demi-vie et le nombre des macrophages dans l’ensemble des organes des animaux, nous avons réalisé des quantifications par cytométrie de flux. Mes résultats révèlent une augmentation du nombre de macrophages dans la cavité péritonéale et dans la rate. Ainsi la survie apportée par l’expression de la protéine anti-apoptotique hBcl2 se traduit par une augmentation du contenu cellulaire. Néanmoins, depuis plusieurs années il est décrit que les macrophages représentent une population hétérogène. En effet, il est rapporté l’existence de macrophages produisant de l’IL-12 et qui se différencient à partir de monocytes en culture in

vitro sous l’action de l’IFNγ. Ces macrophages sont nommés M1 ou classiquement activés, ils

possèdent des propriétés inflammatoires et semblent impliqués notamment dans la reconnaissance et la destruction des tissus lésés en réponse aux infections. Une autre population est décrite, les macrophages M2 ou alternativement activés. Ces macrophages se différencient à partir de monocytes sous l’action de l’IL-4 en culture. Ils sont considérés comme non-inflammatoires et impliqués dans la réparation tissulaire 58 233. Certains

laboratoires rapportent que cette population M2 comprend en fait les véritables M2 responsables de la réparation tissulaire et de la production de produits de la matrice

129 extracellulaire, mais aussi les macrophages dit régulateurs qui sont capables de produire des cytokines anti-inflammatoires telles que le TGFβ et l’IL-10. Dans nos modèles, l’augmentation des macrophages dans les organes des animaux étant associée à une protection contre l’athérosclérose, on peut supposer que le phénotype associé des macrophages est de type M2 ou régulateur 221 226. Basé sur l’expression de certaines protéines comme l’arginase I

ou II, le mannose récepteur, l’iNOS, on peut identifier le phénotype entre M1 et M2. L’aspect fonctionnel de chaque population nécessite aussi d’être précisé. Il est rapporté d’une part que les M2 ont une capacité d’efflux de cholestérol faible avec une diminution d’expression des transporteurs ABCA1/G1, d’autre part, il est montré que ces mêmes macrophages M2 ont une capacité d’efferocytose augmentée avec un activation plus importante des PPAR qui sont connus pour promouvoir l’efflux de cholestérol 55. Une première étape pour mieux

caractériser les populations impliquées dans nos modèles consistera à analyser par RT PCR quantitative l’expression des différents marqueurs de différenciation à partir des ARNm de macrophages péritonéaux. Cependant, l’absence de marqueurs spécifiques de chaque sous population 221 ainsi que la grande plasticité de ce type cellulaire 234 font que le rôle du

macrophage représente un champ d’investigation vaste pour l’avenir de la compréhension de l’athérosclérose.

c. Implication sur les monocytes sanguins. Présence d’une monocytose GR1low.

La protection observée dans nos modèles s’accompagne d’une augmentation sanguine des monocytes Gr1low. L’implication de ces cellules dans l’athérosclérose demeure controversée

aujourd’hui. Certains supposent qu’ils sont anti-inflammatoires et protecteurs par une différenciation en macrophages M2 238, d’autres suggèrent qu’ils patrouillent dans les

130 l’athérosclérose nécessite de plus amples études 239 240. Dans nos travaux, les 2 hypothèses

peuvent être valides. En effet, leur augmentation peut traduire un engagement vers un phénotype de macrophages non inflammatoires si l’on considère que ce type de monocyte est capable d’être recruté et de s’infiltrer dans la paroi vasculaire. D’autre part, si l’on suppose que la population des monocytes GR1low est issue d’une perte d’expression du Gr1 par les

monocytes Gr1hi lorsqu’ils ne sont pas recrutés, cela signifie qu’une augmentation dans la

circulation de ce type cellulaire peut traduire un recrutement de monocytes Gr1hi plus faible.

Or il est montré qu’un défaut de recrutement des monocytes dans le cadre de l’athérosclérose aboutit à une égression des macrophages de la plaque 241. Ainsi, la monocytose Gr1low semble

bien être protectrice. Cette hypothèse est confirmée par l’approche inverse où l’on augmente la sensibilité des macrophages à l’apoptose par délétion de la protéine BclxL spécifiquement

dans le macrophage. On retrouve en effet dans ce modèle une augmentation des lésions avancées associée à une monocytose Gr1hi (annexe 3). Ces résultats suggèrent donc un rôle

protecteur de la monocytose Gr1low.

d. Les monocytes peuvent être précurseurs des CDs conventionnelles. Augmentation des pDCs.

Il est décrit que les monocytes peuvent lors de l’infiltration tissulaire se différencier en cellules dendritiques inflammatoires capables de produire de fortes quantité de TNFα et de NO via l’iNOS (TipDCs) 168163. Ici, la diminution des lésions est associée à une monocytose

Gr1low et l’augmentation d’une population particulière de CD : les cellules dendritiques

plasmacytoïdes. Il est rapporté que les macrophages, les monocytes les pDCs et les cellules dendritiques conventionnelles possèdent un précurseur commun dans la moelle osseuse que l’ont appelle « macrophage and dendritic cell precursor » (MDP) 146 178 242. Il est donc

131 agissent sur les pDCs soit via le précurseur commun, soit via une différenciation encore inconnue des monocytes Gr1low en pDCs.

Les pDCs sont connues pour être responsables de maladies auto-immunes (lupus, encéphalomyélite expérimentale auto-immune) lorsqu’elles reconnaissent via les TLR 7/9 des acides nucléiques issus de la mort cellulaire et produisent ainsi des IFN de type I 243. De plus,

des travaux antérieurs réalisés dans le laboratoire sur l’augmentation de la demi-vie des CDs (CD11c-hBcl2) montrent une légère diminution du cholestérol dans des souris ApoeKO.

L’effet athéroprotecteur qui pourrait en résulter est malheureusement contrebalancé par une augmentation de l’inflammation Th1/Th17 (annexe 2).

Ainsi, il est surprenant que la protection dans nos modèles Mø-hBcl2 soit associée à une augmentation des pDCs puisque d’une part la protection des macrophages contre l’apoptose réduit la quantité de cellules apoptotiques qui pourraient être reconnues via les TLR7/9 44 et

d’autre part puisque ces cellules sont majoritairement inflammatoires via les IFN de type I. L’explication probable est que les pDCs expriment faiblement le CD11c. Ainsi, ce type cellulaire ne serait pas impliqué dans le modèle CD11c-hBcl2. A l’inverse, il est probable que son augmentation dans le modèle Mø-hBcl2 aboutisse à une potentielle augmentation des Treg et une diminution de l’activation des lymphocytes Th puisque ces cellules sont faiblement présentatrices d’antigènes (CMH IIlow). Cet effet permettrait alors de diminuer

l’inflammation et donc de réduire l’évolution de l’athérosclérose.

e. L’impact sur l’immunité adaptative. Réduction du nombre de Th, augmentation des Treg et modulation de l’activation T.

Comme discuté dans le paragraphe précédent, l’augmentation des pDCs dans nos souris transplantées avec la moelle osseuse de donneur Mø-hBcl2 pourrait aboutir à la protection via leur capacité tolérogène. Un article récent démontre en effet que les pDCs sont capables d’être

132 tolérogènes dans l’athérosclérose via une diminution de l’activation et de la prolifération Th1 impliquant la voie de l’indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) 193. Ces travaux peuvent être reliés

à de précédentes études sur des souris splénectomisées retransplantées ou non avec des lymphocytes T issus de la rate de souris athérosensibles ApoeKO. En effet, lorsque les souris

ne sont pas retransplantées les auteurs rapportent une forte augmentation de la taille des lésions comparativement aux souris ayant reçues une opération blanche. La retransplantation de splénocytes T diminue la taille des lésions jusqu’au niveau basal de souris non splénectomisées 117. Ces résultats montrent bien que parmi les LT, certains peuvent diminuer

l’athérosclérose soit par un changement de phénotype et d’activation (Th1/Th2) soit par des aspects régulateurs comme le montre Ait-Oufella et al dans Nature Medicine en 2006 131.

Dans nos souris Mø-hBcl2, nous observons une réduction du contenu en lymphocytes Th. Cette réduction du nombre de cellules peut donc être le résultat de l’augmentation des pDCs que l’on retrouve dans les 2 fonds hypercholestérolémiques. Elle peut aussi être l’effet d’une réduction de l’inflammation sérique via un changement de phénotype des macrophages M1 vers M2/Mreg entrainant une moindre activation des Th. L’analyse de cette population montre que cette réduction s’accompagne d’une augmentation des Treg (CD25hi FR4+). Les pDCs

sont décrites comme capables de favoriser le développement des Treg lorsqu’elles sont immatures et alternativement activées via une voie IDO dépendante 244. De même, les

macrophages Mreg étant capables de produire du TGFβ, ils peuvent promouvoir la production de Treg. D’autre part, je décris une diminution de l’état d’activation des Th pour les animaux en fond hypercholesterolémique ApoeKO. Ces résultats confortent l’implication tolérogène et

régulatrice des pDCs dans les souris ApoeKO comme le décrivent Daissormont et al dans leur

modèle de déplétion des pDCs dans les souris LDLrKO. De plus, l’analyse des populations de

133 une diminution des CD myéloïdes concordant avec une moindre présentation et donc activation des Th.

En revanche, dans notre modèle de survie des macrophages sous fond hypercholestérolémique LDLrKO, les Th sont bien diminués, les Treg augmentés, mais l’état d’activation des

lymphocytes T est augmenté. Dans le même temps, on observe une augmentation des CD myéloïdes. Ainsi, on peut émettre l’hypothèse d’un changement de phénotype d’activation des Th passant d’un profil Th1 à un profil Th2 lorsque les macrophages résistent à l’apoptose puisque les CD myéloïdes chez la souris sont connues pour promouvoir la différenciation Th2 245246247248

.

Ces données suggèrent qu’en parallèle de l’effet majeur de protection médiée par la survie des macrophages et l’augmentation des pDCs commun aux 2 fonds hypercholestérolémiques, différents mécanismes mineurs semblent être impliqués suivant si les animaux expriment l’Apoe.

f. Mécanismes auxiliaires. Réduction de l’inflammasome ou augmentation des LB1.

Ainsi, afin de mieux caractériser l’environnement inflammatoire des souris, nous avons quantifié certaines cytokines sériques. Les résultats révèlent une forte diminution de l’IL-18 et de l’IL-12 chez les souris LDLrKO transplantées avec la moelle osseuse de souris Mø-hBcl2

C57BL/6. Ces deux cytokines ont un rôle important dans la mise en place de l’inflammasome notamment de NLRP3. Cette structure aboutit à l’activation de caspases et favorise donc l’apoptose cellulaire. Il est précédemment montré que l’inflammasome a un rôle important dans la promotion de l’athérosclérose. Diminuer l’IL-12 et l’IL-18 peut donc favoriser la stabilisation voir la régression des plaques 211. Ces résultats coïncident avec la diminution des

134 vérifier le passage d’un phénotype Th1 à Th2. On peut toutefois émettre l’hypothèse que les macrophages des souris LDLrKO possèdent la protéine Apoe qui est impliquée dans le

métabolisme lipidique ainsi que dans l’ensemble des mécanismes d’efferocytose. Ainsi, en augmentant le nombre de macrophages dans les souris Mø-hBcl2, on augmente indirectement la capacité de clairance via l’Apoe.

A l’inverse, dans les souris ApoeKO, on ne retrouve pas de diminution des cytokines

inflammatoires. L’inflammasome ne semble donc pas impliqué dans la protection chez ces souris. Comme les macrophages de ces souris ne possèdent pas l’Apoe, l’inflammation basale se trouve supérieure ce qui est traduit en terme physiopathologique par une cholestérolémie plus élevée et des lésions plus importantes. Cependant, comme le laboratoire a rapporté une augmentation des anticorps IgM T15/EO6 dans ce modèle, que ces mêmes anticorps sont produits par les lymphocytes B de type 1 majoritairement présents dans la cavité péritonéale, et que ces mêmes immunoglobulines sont associées à une protection de l’athérosclérose via une reconnaissance de la phosphorylcholine, j’ai quantifié la population des LB1 dans le péritoine de nos souris transplantées avec la moelle osseuse de souris Mø-hBcl2 ou de leurs contrôles. Les résultats révèlent que dans le fond LDLrKO cette population ne varie pas. A

l’inverse, dans le fond ApoeKO, l’augmentation des macrophages aboutit à une augmentation

des LB1 de 53%. Or d’après de récents articles, les IgM naturelles produites sont capables de fixer les cellules apoptotiques et d’augmenter l’efferocytose soit via la fixation des complexes formés avec le récepteur des parties constantes des immunoglobulines présent sur les macrophages soit via une fixation intermédiaire de la molécule du complément C1q qui pourrait être reconnue par son récepteur aussi présent sur les phagocytes mononucléés 143118.

Grâce à ces travaux, nous obtenons une meilleure connaissance des effets décrits précédemment dans ce modèle Mø-hBcl2. L’augmentation supposée pro-athérogène de la

135 taille des lésions précoces pourrait en réalité refléter une simple augmentation de la cellularité des macrophages à l’intérieur des plaques puisque nous montrons ici que l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl2 augmente le contenu macrophagique de divers organes. Il faut par ailleurs noter que cette cellularité augmentée dans les phases précoces peut être le précurseur de l’effet protecteur sur les plaques avancées. En effet, l’augmentation du contenu en macrophage ne traduit pas obligatoirement une aggravation de l’athérosclérose puisqu’il est rapporté que l’hétérogénéité des sous-types de phagocytes mononucléés entraine une multitude de propriétés variables. Dans cette optique, nous sommes déjà en cours de caractérisation du contenu en macrophage au sein de nos lésions, de même que nous étudions la stabilité des plaques. Des expériences d’analyses sur ARNm sont prévues afin de définir si notre protection est associée à un type particulier de macrophage. Notre hypothèse étant qu’en inhibant la mort du macrophage on permettrait l’augmentation de macrophage de phénotype M2 ou régulateur.

De plus, pour caractériser une probable amélioration de l’efferocytose, dans un premier temps des expériences in vitro sont envisagées sur la capacité de phagocytose de corps apoptotiques par des macrophages dérivés des monocytes de nos souris. Une différenciation à partir des Gr1low ou des Gr1hi permettrait de plus de mieux expliquer les effets de notre monocytose. Si

les expériences en cultures sont concluantes, le passage sur modèle animal en utilisant des souris transgéniques dont les monocytes sont marqués pourrait être envisagé. Induire une apoptose cellulaire dans un modèle animal est possible via l’expression du récepteur humain à la toxine diphtérique. Le croisement de ces 2 modèles animaux permettrait d’observer par fluorescence en microscopie confocale la phagocytose via les monocytes macrophages. L’hypothèse envisagée dans le modèle ApoeKO fait intervenir une efferocytose qui ne

passerait pas par l’Apoe mais par une lymphocytose B1 et une production accrue d’IgM naturelle. Ces immunoglobulines sont reconnues par les phagocytes mononucléés via les

136 récepteur Fc ou le récepteur au C1q. Les IgM naturelles sont aussi capable de reconnaître des épitopes présent sur les cellules apoptotiques. Ainsi, l’efferocytose pourrait être augmenté par ces mécanismes. Pour exploré cette idée, des expériences de cultures entre macrophages et LB1 issus de nos souris sont envisagées, la production des IgM sera analysée ainsi que la capacité de phagocytose de corps apoptotiques. Enfin, pour comprendre les mécanismes liés à la réduction de cholestérol dans nos animaux, des expériences sur les modifications du métabolisme sont réalisables. Les possibilités sont une diminution de l’absorption de cholestérol à partir du bol alimentaire ou une meilleure excrétion dans les fecès. Ceci impliquerait alors l’intestin. Il est aussi possible que certains organes clé dans la régulation du métabolisme des lipides est la capacité de stocker le cholestérol pour le catabolisé ensuite, ceci impliquant le foie. Il est a noté que ces 2 organes possèdent de nombreux phagocytes mononucléés ce qui soutient leur possible implication dans nos modèles.

Finalement, avec ces travaux dans des modèles murins rendus athérosensibles par modifications génétiques dans lesquels nous observons l’effet que peut avoir une réduction de l’apoptose du macrophage sur des plaques préexistantes, nous montrons une protection induite par une augmentation des phagocytes mononucléés. Cette protection est associée à une diminution générale de l’inflammation impliquant différents types cellulaires. Réduire l’apoptose du macrophage se révèle donc une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Toutefois, il faut tenir compte de la difficulté de réalisation d’un tel traitement chez l’homme, mais aussi d’intégrer les risques cancérigènes encourus lors de l’augmentation d’un type