1. L’ubiquitination de PGRP-LC
J’ai montré que le récepteur immunitaire PGRP-LC est ubiquitiné, au moins en partie par des chaînes K48, et dégradé par la voie lysosomale. A l’heure d’aujourd’hui, ce sont plutôt la multi-ubiquitination et la poly-ubiquitination K63 qui sont décrits comme des signaux d’endocytose. Plus récemment, il a été montré que la poly-ubiquitination K29 du récepteur Notch entraînait sa dégradation constitutive par les lysosomes (Chastagner et al., 2008). De plus, plusieurs exemples de récepteurs poly-ubiquitinés K48 existent dans la littérature. Par exemple, le récepteur Smo est à la fois multi-ubiquitiné, pour entrer dans la voie des endosomes, et poly-ubiquitiné K48 pour être envoyé vers le protéasome depuis les endosomes tardifs (Li et al., 2012). De plus, il a été observé que le récepteur IFNAR1 (IFN- α/β Receptor 1) est poly-ubiquitiné par des chaînes K48 et K63 et ces deux types de chaînes sont requises pour l’internalisation et la dégradation du récepteur (Kumar et al., 2007).
Par ailleurs, nous soupçonnons que PGRP-LC soit modifié par d’autres formes d’ubiquitination. J’ai testé la poly-ubiquitination K63 et il ne semble pas que PGRP-LC soit modifié par ce type de chaînes. Les anticorps spécifiques contre les autres chaînes de poly- ubiquitine n’étant pas disponibles, je n’ai pas pu mieux caractériser l’ubiquitination de PGRP- LC. Un des aspects les plus intéressants pour poursuivre ce travail serait d’identifier l’ubiquitine ligase E3 qui catalyse l’ubiquitination de PGRP-LC et de comprendre comment est régulée l’ubiquitination du récepteur immunitaire en réponse à l’infection. Une étude de spectrométrie de masse pourrait éventuellement permettre de déterminer quelle(s) ubiquitine ligase(s) E3 et quel(s) type de chaînes d’ubiquitine sont associés à PGRP-LC, dans différentes conditions (e.g. stimulation par des PGN).
2. Caractérisation de l’endocytose de PGRP-LC
Afin de comprendre plus facilement où se font les régulations de la voie IMD sur le récepteur, il est essentiel de bien maîtriser les étapes du trafic endocytaire de PGRP-LC. Pour répondre à cette question, on pourrait envisager d’effectuer le protocole
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d’immunofluorescence, en co-marquant PGRP-LC et différentes protéines de la voie endocytaire (Rab5 ou Hrs pour les endosomes précoces, Rab7 pour les endosomes tardifs, le LysoTracker ou Lamp1 pour les lysosomes…). Par exemple, le co-marquage avec le LysoTracker ou la protéine Rab11, caractéristique des endosomes de recyclage, permettrait de savoir si l’internalisation de PGRP-LC conduit nécessairement à sa dégradation lysosomale ou s’il peut être recyclé à la membrane via les endosomes de recyclage. Par la suite, il sera alors possible d’observer quelle étape de l’endocytose de PGRP-LC est perturbée par l’ajout d’un RNAi spécifique. En outre, une observation de l’internalisation du récepteur sur des cinétiques plus longues (e.g jusqu’à 4 heures) permettrait de tester si la totalité de PGRP-LC internalisé est dégradée.
3. L’ubiquitination de PGRP-LC est-elle nécessaire à son internalisation ?
J’ai observé, d’une part, que PGRP-LC était ubiquitiné et, d’autre part, qu’il était internalisé. De plus, le blocage du processus endocytaire par extinction génique entraîne une accumulation de PGRP-LC ubiquitiné. En revanche, ces expériences ne prouvent pas de façon certaine que c’est l’ubiquitination de PGRP-LC qui déclenche son internalisation. Afin de tester cette hypothèse, il serait intéressant d’étudier la localisation d’un PGRP-LC qui ne peut plus être ubiquitiné : est-il localisé exclusivement à la membrane ou peut-il toujours internaliser ? Comme la drosophile ne possède qu’une seule enzyme «ubiquitin activating» E1 (Uba1), j’ai voulu tester l’extinction par RNAi de Uba1 sur l’internalisation de PGRP-LC. Cependant, par western blot, j’ai observé que l’extinction de Uba1 par deux RNAi différents ne diminue pas la quantité totale de protéines ubiquitinées dans les lysats cellulaire (résultats non montrés). Notre hypothèse est que le traitement par siUba1 est très délétère pour les cellules et que nous sélectionnons les cellules qui arrivent à s’adapter, par exemple, via une stabilisation renforcée de la protéine Uba1. L’autre possibilité pour bloquer l’ubiquitination de PGRP-LC est de muter toutes ses lysines, du moins celles présentes dans le domaine intracellulaire. Stratégiquement, il faudrait commencer par muter les cinq lysines, qui sont très probablement ubiquitinées selon la prédiction bioinformatique (Annexe 4, Fig. 34).
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175 4. Rôle de USP2 dans le trafic endocytaire de PGRP-LC
USP8, Hrs et Rab5 sont des protéines impliquées dans le processus endocytaire. Donc, l’accumulation de PGRP-LC ubiquitiné causée par leur inhibition peut s’expliquer par le blocage du trafic endocytaire. En revanche, USP2 n’a pas de rôle général connu dans l’endocytose, mais j’ai pourtant observé que son extinction génique conduisait à une accumulation des formes poly-ubiquitinées K48 de PGRP-LC. D’après les expériences préliminaires de cytométrie, il semblerait que l’extinction de Usp2 augmente la quantité de PGRP-LC internalisé dans le cytoplasme. Ce résultat peut être la conséquence soit d’un blocage de l’incorporation de PGRP-LC dans la voie endosomale, soit d’une diminution de son recyclage à la membrane. Or, l’isoforme USP2a déubiquitine EGFR au niveau des endosomes précoces pour favoriser son recyclage à la membrane (Liu et al., 2012). Donc, il est tentant de spéculer que USP2 déubiquitine également PGRP-LC pour le sauver de la dégradation lysosomale et permettre sa réintégration à la membrane plasmique. Afin de vérifier cette hypothèse, il faudrait regarder si la colocalisation entre PGRP-LC et le marqueur des endosomes de recyclage Rab11 est augmentée en présence de USP2. Une autre stratégie est de regarder par cytométrie la variation de la quantité de PGRP-LC à la membrane dans le temps, en bloquant la synthèse protéique par le cycloheximide. De cette façon, on s’affranchit du PGRP-LC nouvellement synthétisé et les variations de la quantité du récepteur à la membrane proviennent de son internalisation et/ou de son recyclage. Enfin, on pourra regarder si ces variations sont modifiées par la sur-expression ou l’extinction génique de USP2.
5. L’endocytose est-elle nécessaire à la signalisation de la voie IMD ?
La question essentielle soulevée par cette étude concerne le lien entre l’endocytose de PGRP-LC et la signalisation de la voie IMD. En effet, l’internalisation des récepteurs membranaires a longtemps été considérée comme un moyen d’arrêter la signalisation en permettant leur dégradation. Mais, de plus en plus d’informations suggèrent que beaucoup de récepteurs sont actifs pendant ou après leur internalisation et que la signalisation continue le long de la voie endocytaire. Par exemple, l’endocytose du récepteur Toll de la drosophile est strictement nécessaire à la signalisation. Dans certains cas, comme celui du TNFR-1 des mammifères, l’internalisation intracellulaire assure la sélectivité des signaux activés. Donc,
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l’endocytose contrôle la signalisation cellulaire, en couplant et intégrant différentes cascades de signalisation, à la surface de vésicules endocytaires, afin de contrôler la qualité, l’intensité, la distribution et la durée de la signalisation.
Dans un premier temps, nous avons observé, à plusieurs reprises, que l’extinction de
Usp8 n’induit pas une activation constitutive ou une sur-activation de la voie IMD. Ce résultat
peut s’expliquer par le fait que, lorsque Usp8 est éteint, PGRP-LC peut être accumulé sous une forme ubiquitinée inactive qui n’est plus capable de signaler ou bien que ce récepteur est déjà engagé dans les vésicules intraluminales : à cette étape, la transduction du signal par PGRP-LC ne peut plus avoir lieu. En outre, j’ai également observé, par le test luciférase, l’effet de l’extinction des gènes codant pour les protéines endocytaire Hrs et Rab5 et, malheureusement, aucun résultat significatif et reproductif n’a été observé. Cela provient sûrement du fait que la présence des siHrs et siRab5 est très délétère pour les cellules S2, comme il a été observé lors des expériences de cytométrie. Par la suite, il serait intéressant de mesurer par RT-qPCR l’activation de la voie IMD, c’est-à-dire l’expression de l’attacine et de la diptéricine, dans des mouches transgéniques, où Hrs ou Rab5 ont été éteints. Cette expérience devra être faite à partir de mouches infectées par piqûre ou non-infectées. De plus, il est possible que les étapes précoces de l’endocytose soient nécessaires à la transduction du signal de PGRP-LC, alors qu’une fois engagé dans les endosomes précoces, PGRP-LC est destiné à être dégradé pour réguler négativement la voie IMD. C’est pourquoi, il faudrait également tester l’effet du dynasore, un inhibiteur de la dynamine intervenant précocement dans l’endocytose (détachement de la vésicule enrobée de clathrine de la membrane cellulaire), sur l’activation de la voie IMD.
Par ailleurs, la protéine PIMS (PGRP-LC-interacting inhibitor of IMD Signaling), ou aussi nommée Pirk ou Rudra, est un régulateur négatif de la voie IMD. L’expression du gène
pims est induite en réponse à l’infection par des bactéries à Gram négatif et, dans l’intestin,
son expression basale repose sur la présence de la flore commensale, permettant d’éviter une activation inappropriée de la voie. De plus, la protéine PIMS interagit avec PGRP-LC, PGRP- LE et Imd (Aggarwal et al., 2008; Kleino et al., 2008; Lhocine et al., 2008). De façon intéressante, il a été observé que PIMS change la localisation subcellulaire de PGRP-LC (Lhocine et al., 2008). En effet, la présence de PIMS entraîne une réorganisation de PGRP-LC de la membrane vers des structures organisées du cytoplasme. Donc, il est probable que PIMS
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177 favorise l’internalisation de PGRP-LC, et, pourquoi pas, sa dégradation dans les lysosomes, ce qui serait cohérent avec son rôle de régulateur négatif de la voie IMD.