En étudiant l’effet des différents domaines de l’ORF1 sur la voie de signalisation RLR, nous avons observé par test rapporteur luciférase une inhibition de l’activité du promoteur IFN-β par les domaines PCP et MetPCP de l’ORF1 du HEV (Figure 37). Afin de déterminer par quel mécanisme les domaines PCP et MetPCP inhibent la voie RLR, nous avons réalisé un crible en GPCA avec certaines protéines de cette voie de signalisation. Ce crible nous a permis d’identifier IKK-ε, TANK et NEMO comme de potentiels partenaires cellulaires des domaines PCP et MetPCP du HEV. De plus, une interaction potentielle entre le domaine PCP et la protéine TBK1 a été rapportée dans un crible réalisé par Damien Vitour (données non montrées).
Les protéines IKK-ε, TBK1, NEMO et TANK font partie du même complexe (voir Introduction Figure 12), suggérant que les domaines MetPCP et PCP interagiraient avec une ou plusieurs protéines de ce complexe. Les valeurs NLRs élevées obtenues avec certaines de ces protéines cellulaires pourrait alors indiquer un rapprochement de MetPCP et PCP au sein de ce complexe, plutôt qu’une interaction directe.
En perspective, la potentielle interaction entre les domaines MetPCP et PCP de l’ORF1 du HEV et les différentes protéines du complexe devra être confirmée par d’autres méthodes que la GPCA telles que par co-immunoprécipiation ou par co-précipitation avec les domaines MetPCP et PCP fusionnés à la GST. Ces vecteurs d’expression-GST sont déjà disponibles grâce à la méthode de clonage Gateway. D’autres techniques seront utilisées pour valider l’inhibition de l’activité du promoteur IFN-β par les domaines PCP et MetPCP de l’ORF1 et examiner le mécanisme impliqué comme par exemple l’analyse du niveau de phosphorylation des protéines IRF3, IRF7, IKK-ε et TBK1 par immunoblot ou l’analyse de la translocation de IRF3 et IRF7 dans le noyau par IF.
Le domaine MetPCP et le domaine PCP seul possèdent une activité de déubiquitinylation des protéines 104,557. Notamment, le domaine PCP d’une souche de HEV-1 déubiquitinyle RIG-I et TBK1 557. Il est possible qu’en se liant à une des protéines du complexe NEMO-IKKε-TBK1, les domaines MetPCP et PCP déubiquitinylent ces protéines, ce qui inhibe leur activation. Nous avons vu dans l’introduction (paragraphe II-C-1-a-) que TBK1 est ubiquitinylé en K63 par différentes protéines cellulaires et que cette ubiquitinylation est nécessaire à son activation. La polyubiquitinylation en K29 de NEMO par TRAF7 et sa polyubiquitinylation en K63 sont nécessaires à son activité. Il est donc possible qu’en déubiquitinylant TBK1 ou NEMO, les domaines PCP et MetPCP inhibent la voie RLR. Certaines protéines virales présentant un domaine similaire au PCP du HEV possèdent une activité de DUB et sont capables de déubiquitinyler TBK1. Par exemple, la protéine Nsp3 du MHV et la protéine Lpro du FMDV déubiquitinylent TBK1 pour inhiber l’induction de l’IFN-I 462,576. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse qu’en se liant à TBK1 ou NEMO, les domaines PCP et MetPCP du HEV le déubiquitinyle, ce qui inhibe son activation et par conséquent l’activité du promoteur IFN-β. L’interaction la plus forte du domaine PCP rapportée dans notre étude en GPCA est une interaction avec IKK-ε. Cependant, aucun mécanisme régulateur d’ubiquitinylation n’a été
mis en évidence pour cette protéine et il est possible que PCP utilise un autre mécanisme pour bloquer la signalisation IFN-I en se liant à cette protéine.
Le domaine PCP d’un HEV-1 déubiquitinyle RIG-I 557. Cependant, aucune interaction entre le PCP du HEV-1 et RIG-I n’a été rapportée dans cette étude. Dans notre crible en GPCA, nous n’avons pas observé d’interaction entre le domaine PCP du HEV-3 et RIG-I, suggérant que soit le domaine PCP du HEV-3 est capable de déubiquitinyler la protéine cible sans se lier à elle, soit que le PCP du HEV-1 interagirait avec RIG-I et pas celui du HEV-3. Afin de tester ces hypothèses, le clonage des différents domaines de l’ORF1 d’un HEV-1 a été entrepris.
III- Comparaison de l’effet de l’ORF1 du HEV-3 sur les voies de signalisation de l’IFN-I avec l’effet de l’ORF1 du HEV-1
Au début de ce travail de thèse, une étude a été publiée sur l’effet des domaines de l’ORF1 du HEV-1 (souche pSK-E2) sur la voie de signalisation RLR et a montré que les domaines PCP et X inhibent l’activité du promoteur IFN-β. En analysant plus en détail l’effet de ces domaines sur la voie de signalisation, il a été montré que le domaine X inhibe la phosphorylation de l’IRF3 et que le domaine PCP déubiquitinyle RIG-I et TBK1 557. L’effet du domaine MetPCP du HEV-1 sur la voie RLR n’a pas été analysé dans cette étude.
Nous avons montré au cours de notre travail que le domaine X du HEV-3 n’a pas d’effet sur l’activation du promoteur IFN-β. Nous avons alors souhaité savoir quelles étaient les différences entre les deux génotypes HEV-1 et HEV-3 (Tableau 3). Le domaine X de la souche de HEV-3 utilisée dans nos expériences présente 83% d’identité de séquence en acides aminés avec le domaine X de la souche de HEV-1 pSK-E2. Cette différence au niveau de la séquence pourrait expliquer une différence de fonction des deux domaines. De plus, le domaine PCP de la souche de HEV-3 présente seulement 69% d’identité de séquence en acides aminés avec le domaine PCP de la souche de HEV-1 pSK-E2. Il est donc possible que le PCP du HEV-3 ait la même fonction que le PCP du HEV-1 grâce à des motifs conservés mais aussi que certaines fonctions pas encore caractérisées ne soient pas conservées entre génotypes.
Nous avons alors souhaité comparer l’effet des différents domaines d’interêt de l’ORF1 d’une souche de HEV-1 et de ceux d’une souche de HEV-3 sur les voies de signalisation du
système IFN-I. Nous nous sommes également demandé si le domaine PCP du HEV-3 possédait la même activité DUB de RIG-I et TBK1 que le domaine PCP du HEV-1. Nous avons également souhaité comparer l’effet du domaine MetPCP du HEV-3 avec l’effet du MetPCP du HEV-1 sur la voie JAK-STAT.
Afin de comparer l’effet des deux génotypes sur les voies de signalisation RLR et JAK-STAT, nous avons construit des vecteurs d’expression codant pour les domaines MetPCP, Y, PCP et X de l’ORF1 d’une souche de HEV-1 lié à leur extrémité N-terminale à une étiquette 3FLAG, GFP, Gluc1 et Gluc2.
MetPCP Met PCP X Y
HEV-1 (pSKE2) vs HEV-1 99% 99% 99% 99% 99%
HEV-1 (pSKE2) vs HEV-3 85% 88% 69% 83% 95%
HEV-1 vs HEV-3 85% 89% 69% 82% 94%
Tableau 3. Tableau comparatif du pourcentage d’identité en acides aminés entre les différentes souches de HEV décrites ici pour chaque domaine de l’ORF1 étudié.
La souche de HEV-1 (pSK-E2) a permis de montrer dans une publication un effet inhibiteur des domaines PCP et X du HEV-1. Les souches HEV-1 et HEV-3 sont celles utilisées dans le laboratoire.