Discussion et perspectives

Discussion et perspectives

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Préambule

Les écosystèmes aquatiques sont soumis à une large gamme de facteurs abiotiques. Les estuaires en particulier sont alimentés en eau douce par leurs affluents en amont et en eaux salines en aval par la remontée de l’océan dans les zones côtières, remontant en Gironde jusqu’à 150 km en amont de l’embouchure. A cela s’ajoute une variation de la température au cours de ce mélange des eaux. Les espèces aquatiques vivant dans un tel milieu sont par conséquent soumises aux changements de salinité et de température d’amont en aval de l’estuaire, les contraignant à coloniser un milieu propice à leur physiologie, où à s’adapter aux variations physico-chimiques auxquelles elles sont soumises. En outre, l’impact de l’activité humaine a conduit à la réduction des territoires et à l’émission de polluants qui se sont largement accumulés au sein de ces systèmes et des organismes.

La question qui a amené à réaliser les travaux présentés dans cette thèse était de savoir s’il était possible de détecter et démêler les effets de chaque contaminant présent en mélange dans ces systèmes aquatiques et de les dissocier des effets des facteurs naturels au niveau de la transcription des gènes des organismes. L’anguille, du fait de sa capacité exceptionnelle à s’adapter à son environnement, a su coloniser une large gamme de milieux. De plus, son mode de vie benthique et sa place dans la chaine alimentaire permettent de prendre en compte les différentes voies de contamination, rendant cette espèce pertinente pour répondre à la question soulevée. En outre, pour tenter de répondre à cette interrogation nous avons utilisé deux approches transcriptomiques, le séquençage haut débit et la puce à ADN.

Salinité; Température; Stress anthropiques

Ecosystèmes

aquatiques

Impact sur les gènes impliqués dans la stéroïdogenèse et la

régulation de FOXO1 = ↓croissance des gonades

Maturation sexuelle en laboratoire d’anguilles sauvages argentées

A. anguilla A. Anguilla B. A. rostrata Transcriptome du foie par séquençage haut débit Sélection de gènes candidats Puce à ADN Puce à ADN In situ Laboratoire Gonades

Bonne discrimination des contaminations de laboratoire

et de terrain

Fort effet du laboratoire sur la réponse transcriptomique

Foie

Nageoire

↑ Nombre de gènes affectés = ↑ toxicité ? Denslow et al., 2007

Figure 7.1 : Synthèse des résultats des travaux réalisés dans cette thèse

1

Ecosystèmes

aquatiques

Discussion et perspectives

169 1. Discussion générale

1.1 Approche anguille jaune

Le premier travail de cette thèse était de relier sans a priori des gènes à un facteur anthropogénique ou naturel et de leur attribuer à chacun une « signature » spécifique à partir d’animaux prélevés en milieu naturel. Le résultat le plus marquant était dans le nombre de gènes associés à chaque facteur qui n’était pas proportionnel à la concentration retrouvée dans les organismes échantillonnés. En effet, si le Cd a été associé à un grand nombre de gènes du fait de sa forte teneur mesurée dans les anguilles dans notre étude, l’arsenic a, quant à lui, été associé à un pourcentage similaire, pourtant marqué par un faible gradient de concentration entre les sites de l’étude. La même tendance a été observée pour le lindane qui a été relié avec le plus grand nombre de gènes de l’ensemble des facteurs testés. Notons de plus que sa contribution à la concentration totale des organochlorés était de l’ordre de 2% en moyenne par site. En toxicologie et en écotoxicologie, l’estimation des risques d’un contaminant pour un organisme est déterminée au travers de tests communément basés sur le concept de la dose-réponse permettant de déterminer les seuils de concentration où aucun effet n’est observé (McCarty et Mackay, 1993). Cependant, ce principe de la dose-réponse est controversé et de nouveaux concepts sont avancés notamment par le modèle du « seuil » où des réponses peuvent être mesurées à très faible doses, soit en dessous des concentrations NOAEL (No observed adverse effect level) (Calabrese et Baldwin, 2002). Au regard de la LC50 (concentration pour laquelle 50% de mortalité est observée) pour le lindane et les PCBs chez la perchaude (Perca flavescens) (source US National Library of Medecine ; http://webwiser.nlm.nih.gov/), le lindane est 5 fois plus toxique que les PCBs en contamination directe. Au niveau des réponses transcriptomiques, les PCBs sont associés à 1% des gènes contre 12% pour le lindane ce qui pourrait être en accord avec leur toxicité respective. Cette observation pourrait s’accorder avec les travaux de Denslow et al. 2007. Ces auteurs proposent en effet un continuum des réponses transcriptomiques où le nombre de gènes transcrits augmente avec l’effet toxique des contaminants (dose et temps). La quantification du nombre de gènes différentiellement transcrits pourrait être ainsi utilisée pour évaluer la toxicité d’une substance et d’en prédire les effets néfastes sur l’individu. Ce résultat relate en outre l’évidence d’un effet non négligeable au niveau de la transcription des gènes même à très faibles doses d’un contaminant. Cela remet en question l’utilisation en laboratoire de doses parfois irréalistes par rapport au milieu naturel pour évaluer les effets

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toxiques d’une substance sur un organisme, où l’interprétation des résultats serait difficilement applicable sur le terrain.

L’étude réalisée au moyen de la puce à ADN sur le foie des deux espèces d’anguilles d’Atlantique échantillonnées dans leur environnement naturel et des anguilles Européennes exposées à différents facteurs environnementaux en laboratoire a donné deux résultats majeurs (chapitre 4). Le premier était le constat d’une séparation notable des profils établis sur les animaux exposés en laboratoire et ceux établis sur les individus sauvages. Les gènes différentiellement transcrits entre les conditions en laboratoire et de terrain ont mis en avant l’influence possible du stress de la captivité des animaux maintenus en aquarium sur le système immunitaire et la croissance des individus. En effet, les contraintes techniques du laboratoire engendrent des biais dans les réponses des animaux, soumis non seulement au stress fixé par l’expérimentateur, mais aussi aux stress endogènes à l’expérimentation elle-même. Les anguilles, au stade jaune, ont un comportement plutôt solitaire en milieu naturel et l’influence d’un environnement restreint avec plusieurs congénères pourrait « masquer » les effets propres au stress initialement testé. Néanmoins, il est important de souligner que si les effets du stress du confinement sont relativement bien marqués au niveau du foie par une augmentation du cortisol dans les premiers jours suivants le stress du confinement (Vijayan et al., 1997), une étude a montré que le niveau de cortisol retourne à son niveau basal après plusieurs jours suivant le stress (Trenzado et al., 2003). Plus récemment une étude s’est intéressée à la dynamique de la réponse au niveau de l’expression des gènes hépatiques (mesurée au moyen d’une puce à ADN) sur des poissons soumis à un stress de confinement en aquarium pendant 120 h. L’expérience a montré que la réponse au stress est complexe et varie dépendamment du temps (Calduch-Giner et al., 2010). Selon les auteurs, la réponse serait divisée en trois phases : précoce, différée et adaptative. Ces phases correspondraient à un ajustement spécifique des cellules donnant lieu à i) un approvisionnement rapide de l’énergie, ii) un remodelage des processus biologiques et de réparation tissulaire, iii) un rétablissement de l’homéostasie. Bien que ces travaux soient difficilement assimilables à la présente étude, du fait que les anguilles aient été maintenues sur une plus longue période en aquarium (supérieure à 45 jours), la séparation notable des anguilles de laboratoire à celle du terrain laisse supposer un impact possible de la captivité sur les réponses transcriptomiques. Aussi pouvons-nous nous demander, au vu de l’influence du stress sur l’expression des gènes, si le foie représente un organe pertinent pour discriminer les effets de chaque facteur en milieu naturel ?

Discussion et perspectives

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Cependant, il est nécessaire de rappeler que la confrontation des profils établis au niveau du foie avait permis toutefois de regrouper quatre des cinq animaux de la

contamination aux PCB à 50 ng.g^-1 (concentration basse) avec des individus provenant des

sites Saint-François et Saint-Pierre dont les concentrations en PCBs dans le muscle étaient proches de celles mesurées dans les individus expérimentaux. Aussi pourrait-on conclure que le foie permet de discriminer efficacement une contamination en condition naturelle lorsque cette dernière est similaire dans les tissus des animaux expérimentaux et sauvages ? La réponse demeure difficile à donner. En effet, la nature organique des PCBs fait que ces derniers peuvent se bioaccumuler le long de la chaine alimentaire (Porte et Albaigés, 1993 ; Letcher et al., 1998). Les facteurs de bioconcentration (BCF) très élevés des PCBs (BCF= 68000 ; Nendza et al., 1997) dans la chaine trophique font que les espèces situées en fin de chaine peuvent ainsi atteindre des teneurs importantes de ces contaminants dans leurs organes les plus lipophiles comme le muscle dans le cas de l’anguille. Dans notre expérience, nous avions choisi des teneurs en PCBs dans la nourriture similaires à celles mesurées dans les proies des anguilles en Gironde afin d’être au plus proche des conditions environnementales. Au bout de 45 jours d’exposition aux PCBs par la voie trophique, une bioaccumulation moindre comparée aux anguilles de Gironde ou de Garonne avait été observée : 170 ± 2,67

ng.g^-1, 1587±53,7 ng.g^-1 et 1712,45 ± 0,24 ng.g^-1 pour la condition de laboratoire, la Garonne

et la Gironde respectivement reflétant ainsi la difficulté majeure à reproduire la complexité des expositions en milieu naturel tant par la concentration que le temps d’exposition. Si l’on regarde également l’âge des anguilles de l’estuaire du Saint-Laurent et de la Gironde, les anguilles Américaines étaient deux fois plus âgées que les anguilles Européennes (14 ± 2,13 ans et 7 ± 0.8 ans respectivement). Les anguilles Américaines ont probablement été ainsi en contact plus longuement avec les contaminants de leur milieu que les anguilles Européennes dans notre étude. Au vu des différences de concentrations en PCBs observées dans les

muscles des anguilles de Saint-Pierre et Saint-François (99,2 ± 33,28 et 67,64 ± 5,5 ng.g ^-1,

respectivement) comparées à celle mesurées en Garonne et Gironde, la contamination de la chaine trophique dans les rivières du Saint-Laurent semble être bien moins importante qu’en Gironde. La réponse transcriptomique des anguilles soumises à une exposition aux PCBs en condition de laboratoire, semble alors plus refléter une longue contamination mais à très faible concentration de ces derniers dans l’environnement. En d’autres termes, la pression expérimentale exercée par une contamination forte (contamination de la Gironde) et sur une courte période (45 jours) reflèterait la pression environnementale exercée au long terme par de très faibles concentrations de ce contaminant dans la chaine trophique. Il faut néanmoins

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modérer ce propos du fait qu’en expérimental la nourriture était contaminée artificiellement à partir d’un broyat de chair de poissons donc sans biotransformation potentielle dans les organismes proies qui pourraient en modifier la biodisponibilité ou la toxicité par exemple (Buckman et al., 2006). De plus, la nourriture était faite à partir d’une seule espèce de poisson et les anguilles ont été nourrie ad libitum, ne reflétant alors pas le régime alimentaire réel des anguilles et pouvant modifier leur métabolisme ou leur croissance (Boisclair et Leggett, 1989).

L’étude de l’expression des gènes mesurés dans la nageoire caudale (Cf chapitre 5) des anguilles jaunes expérimentales et de terrain a permis de relier deux conditions expérimentales (Cd et PCB) avec les animaux provenant de l’estuaire de la Gironde. La nageoire offrirait ainsi une bonne discrimination des différentes conditions testées. Les concentrations des expositions ayant été fixées à des niveaux retrouvés dans les milieux naturels ajoute un argument en faveur de l’utilisation pertinente de la nageoire en écotoxicologie.

Par ailleurs il est important de noter que les gènes sélectionnés pour la construction de la puce à ADN ont été choisis à partir des niveaux de réponse issus du foie. La nageoire n’étant pas un organe central dans le métabolisme général des organismes, certains gènes exprimés dans le foie ne sont probablement pas ou peu exprimés dans cet organe plus « neutre » métaboliquement, induisant alors une réponse très différente entre ces deux tissus. Il semblerait en outre que l’expression des gènes soit moins « affectée » par le stress de l’expérimentation elle-même et reflèterait d’avantage l’influence des facteurs testés. La nageoire pourrait alors représenter un organe pertinent pour discriminer plus finement les effets de chaque facteur. Néanmoins la similarité des profils établis sur le foie des anguilles

exposées aux PCB à 50 ng.g^-1 et des anguilles de terrain n’est pas à négliger. De plus, l’étude

sur la nageoire s’est restreinte à un faible nombre de conditions contrairement au foie favorisant la liaison d’un profil de laboratoire avec un profil de terrain. L’utilisation conjointe des deux organes à ce stade des connaissances reste alors primordiale.

Une observation intéressante relevée au cours de ces travaux est l’influence notable du temps. Le temps est l’un des paramètres majeurs dans la contamination des organismes terrestres et aquatiques. En effet, Greenfield et al. en 2005 ont mis en évidence des variations de contamination inter-saisonnières, interannuelles mais également sur deux décennies dans différents poissons de la baie de San Francisco. Ces variations au cours des années seraient notamment dues aux changements d’utilisation de certains produits contaminants, modifiant ainsi les tendances de contamination dans le temps. Ainsi, bien que les mesures d’expression

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des gènes soient à un instant t, à un moment particulier dans l’histoire de vie de l’individu, l’historique de contamination d’un individu qui a évolué dans un environnement contaminé va probablement influencer la réponse mesurée à cet instant t. La comparaison des profils transcriptomiques établis pour un contaminant à partir des données du RNA-seq (individus de terrain) et des puces à ADN (individus exposés en laboratoire) n’a donné par exemple que cinq et six gènes en communs dans les profils établis pour le Cd et les PCBs, respectivement (données non présentées). Le fait qu’un très faible nombre de gènes soient communs entre les profils établis sur des animaux de terrain et expérimentaux pourrait souligner une réponse très différente des individus soumis à un stress sur un temps court ou long. En plus d’un effet lié à la captivité (discuté plus haut), la séparation des individus sauvages et exposés en laboratoire pourrait également être le fait d’une réponse différente à une contamination chronique (long terme) ou aigue (court terme). L’hypothèse qui pourrait être posée serait que dans le cas d’une forte contamination multiple et longue (plusieurs années), les individus auraient une réponse plus générale à la pollution et non particulière au contaminant le plus présent et « toxique » dans l’environnement. Une réponse qui pourrait étayer cette hypothèse serait le lien établi entre le profil d’expression de gènes des individus exposés à une température froide et des individus provenant des sites « contaminés » (Dordogne, Garonne, Gironde et Saint-Pierre). Les gènes communément retrouvés dans l’ensemble de ses profils sont impliqués dans des mécanismes épigénétiques. Ces mécanismes sont des modifications au niveau des histones ou de l’ADN qui peuvent modifier l’expression des gènes sans changer l’information génétique (Wolffe and Guschin, 2000 ; Bollati et Baccarelli, 2010). Ces mécanismes peuvent être influencés par les facteurs environnementaux, dont les polluants, et aboutir à un nouveau phénotype cellulaire (Baccarelli et Bollati, 2009). La réponse similaire d’individus exposés à des contaminants multiples ou à une température froide décrite en chapitre 4 (changement de l’utilisation des réserves énergétiques dans la cellule notamment) pourrait alors être le résultat d’un changement profond du phénotype cellulaire pour survivre dans un environnement pollué. L’implication de gènes liés à l’épigénétique communément retrouvés dans le foie et la nageoire chez les individus exposés au Cd en laboratoire (chapitre 5) sous-tendrait une induction de mécanismes épigénétiques différents à court et long terme ou un effet particulier de ce métal sur ces mécanismes. En effet, Baccarelli et Bollati en 2009 ont réalisé une synthèse des effets sur les mécanismes épigénétiques de contaminants métalliques et organiques. Cette étude montre que le Cd a une influence sur la méthylation globale de l’ADN comparativement à d’autres contaminants dont les effets sont plus ciblés sur un gène particulier. Les travaux de Pierron et al., 2014 ont également montré une hypermethylation de

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l’ADN d’anguilles immatures exposées au Cd pendant 45 jours. Il ne faut cependant pas omettre que les anguilles de laboratoire avaient été initialement prélevées sur le site de Certes, le site référence de l’étude. Ces animaux, au moment de l’échantillonnage, avaient alors un « passé » transcriptomique propre à leur histoire de vie. Ces traits de vie auraient pu influencer les réponses transcriptomiques observées en laboratoire, dont les réponses épigénétiques.

Un dernier résultat marquant était les différences des réponses observées entre les individus issus d’un même site ou d’une même contamination en laboratoire. Il semble en effet, que les individus exposés à de fortes concentrations (sites les plus contaminés et la

condition PCB_50 (les anguilles exposées à 300 ng.g^-1 de PCB n’avaient pas montré

d’accumulation notable) et à température faible notamment présentent une réponse transcriptomique plus homogène. Cette homogénéité est marquée par un lien hiérarchique fort entre ces deux facteurs dans les dendrogrammes. A contrario, une réponse plus hétérogène a été observée chez les individus témoins ou les PCB_300 par exemple. Il semblerait alors que les individus convergent vers une même réponse dans un scénario où la contamination est élevée. Autrement dit une contamination forte effacerait une partie de la variabilité interindividuelle existante et « forcerait » les organismes à « exprimer » une réponse commune pour endurer la contamination. La force de cette étude consistant à travailler, en partie, au niveau individuel a permis de souligner l’importance de la variabilité entre les individus à répondre à une perturbation. Cette variabilité de transcription des gènes est appelée « bruit d’expression génétique » (ou gene expression noise » en anglais). En écotoxicologie, la réponse est plus souvent mesurée à partir de la moyenne plus ou moins son écartype. Cette réponse moyennée est ensuite comparée à une autre moyenne issue d’une autre condition. Cette vision efface alors ces fluctuations de réponse qui pourtant pourraient représenter une part non négligeable de la réponse des individus à une contamination (Devin et al., 2014). Si une faible contamination semble ne pas effacer l’hétérogénéité des individus, quels mécanismes pourraient conduire à une réponse plus homogène des individus exposés à plus fortes doses ? Une réponse pourrait être apportée avec le modèle de l’« autorégulation négative » (ou « negative feedback » ; NF) développé par Nevozhay et al., 2009. Ce concept est basé sur des travaux au cours desquels des levures Saccharomyces cerevisiae ont été modifiées génétiquement. Ces dernières présentaient différentes constructions génétiques

associant un promoteur (PGal1-D12) à gène rapporteur (yEGPF) et plus en amont un gène

répresseur (tetR), ce dernier étant lui-même associé ou non à la même région promotrice (PGal1-D12 ouPGal1) que celle utilisée en amont du gène rapporteur (Fig 7.2 A et B). La fixation

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de la protéine tetR sur la région promotrice (P_Gal1-D12)empêche l’expression du gène adjacent,

aucune fluorescence est alors émise (Fig 7.2 B). Si le gène tetR possède la même région

promotrice P_Gal1-D12, la protéine tetR va se fixer alors sur cette région et va inhiber

l’expression du gène rapporteur mais aussi celle du gène tetR, c’est l’autorégulation négative (NF). L’introduction d’une molécule extracellulaire, ici l’anhydrotétracycline (ATc) empêche

la fixation de la protéine tetR sur la région promotrice (PGal1-D12), (tetR) (Fig. 7.2 D). L’ATc

permet ainsi de lever l’inhibition engendrée par la protéine tetR et permet la transcription du gène. La transcription du gène rapporteur est mesurée par fluorescence en fonction de la concentration en ATc dans le milieu. En absence en amont du gène tetR d’une région promotrice permettant l’autorégulation négative de ce gène répresseur, la courbe de la réponse du gène yEGFP en fonction de la concentration en ATc est sigmoïdale. L’apport d’un promoteur introduisant la NF linéarise alors la réponse quelle que soit la dose en ATc, diminuant ainsi les fluctuations ou « bruit » des réponses. Ce mécanisme permettrait une