Discussion …

III. Discussion

Cette étude a été réalisée dans le but d’évaluer l’activité antioxydande des extraits brutes de deux plants: Urtica dioïca et Mentha rotundifolia. Ces deux plantes de la région de Jijel sont mutilées localement par la médicine traditionnelle, raison pour la quelle nous avons procédé à l’extraction des polyphénols responsables de son éventuelle activité antioxydante.

L’efficacité de l’extraction des composés phénoliques à partir de la matière végétale dépend de la méthode d’extraction, de la granulométrie de la poudre utilisée et du temps de macération (Naczk et Shahidi, 2004; Rodriguez-Meizoso et al., 2006). Elle dépend également, de la température et de la nature du solvant (Rodriguez-Meizoso et al., 2006).

Dans la présente étude, l’extraction est réalisée à partir de la partie aérienne de deux plants. Nous avons utilisé le méthanol comme solvant, et un dosage de polyphénols furent réalisés afin de choisir la meilleure plante. Après séchage au rotavapor, le recouvrement, était de 13,04% et 8,36% pour Mentha rotundifolia et Urtica dioïca respectivement, les pertes étaient importantes. Ceci s’explique par la solubilité des composés phénoliques dans le solvant d’extraction et leur degré de polymérisation ou à leur implication dans l’autres structures moléculaires formants ainsi des complexes insolubles (Cacace et Mazza, 2002; Falleh et al.,

2008).

L’étude quantitative des extraits bruts de Mentha rotundifolia et Urtica dioïca, au moyen des dosages spectrophotométriques, avait pour objectif de déterminer leurs teneur den polyphénols totaux, en flavonoïdes et en tannins. La raison principale pour le choix de ces substances réside dans le fait que la majorité des propriétés antioxydantes des plantes leur sont attribués.

Les polyphénols sont estimés par plusieurs méthodes dont la méthode de Folin-Ciocalteu. Les résultats du dosage des polyphénols totaux montrent que l’extrait de Mentha rotundifolia représente l’extrait le plus riche avec: 745,66 mg EAG/gEB par rapport à l’extrait de Urtica dioïca (391,1 mg EAG/gEB).

Ces résultats sont supérieures aux résultats cites par Madi (2010) réalisé sur Mentha piperita qui étaient à l’ordre de 309,42 mg/g et les résultats de Bencheikh (2012) réalisé sur l’extrait méthanolique de Mentha pulegium qui à étaient ordre de 183,45 mg/g.

Les tenure en composé phénolique obtenues par Daoudi et al., (1997) travaillant sur les espèces d’Urtica piluliferae, Urtica membranacea et Urtica urens sont de l’ordre de 2,313 mg/30g, 1,498 mg/30g et 0,06 mg/30g respectivement et qui sont largement inferieures à nos résultants (391,1 mg/30g).

Le contenu polyphénolique varie qualitativement et quantitativement d’une plante a l’autre cela peut être attribué à plusieurs facteurs comme les conditions d’extraction en terme de température et le nombre d’étapes d’extraction (Scalbert, 1991; Escribano-Baillon et al., 2001; Santos-Buelga et al., 2000; Suhaj, 2006; Tawaha et al., 2007) ainsi que l’état et l’origine de l’échantillon en terme de provenance géographique et le matériel végétal appartenant à des espéces différentes, aussi la saison de collecte et de cultivar ( Ranalli et al., 2006; Falleh et al.,2008; Li et al., 2009)

La détermination quantitative des flavonoïdes été effectuée par la méthode de trichlorure aqueux. Les résultats montrent que les feuilles de Mentha rotundifolia enregistrent la plus forte tenure en flavonoïdes 102,5 mg EQ/gEB et les feuilles d’Urtica dioïca sont les moins riches en flavonoïdes 48,43 mg EQ/gEB.

D’après les travaux réalisé sur le même genre de la Menthe, Madi (2010) trouvé une teneur de 48mg/g chez Mentha piperita. Conforti et al., (2008a) obtenue une teneur de 15,75 mg /g chez

Mentha aquatica. Ces résultats sont inférieurs à nos résultats. Les tenure en flavonoïdes obtenues par Daoudi et al., (1997) travaillant sur les espèces d’Urtica piluliferae, Urtica membranacea et Urtica urens sont de l’ordre de0,337 mg EQ/30g, 0,05 mg EQ/30g , 0,005 mg EQ/30 g respectivement et qui sont largement inferieures à nos résultants (48,34mg/g).

La différence de la solubilité des flavonoïdes dans différents solvants, qui est liée à leur diversité structurale, peut affecter leurs quantifications (Sharififar et al., 2009).

D’après Rawel et al., (2005), les méthodes de conservation et d’exposition à la lumière des plantes peuvent affecter la teneur en flavonoïdes. En effet. Ceux-ci sont sensibles à l’oxydation et ont tendance à former des polymères donnant ainsi des tannins condensés (Manach et al.,

2004) ce qui pourrait expliquer ces différences de concentrations. Aussi. La composition en flavonoïdes d’une plante dépend de la température et des quantités de phosphore d’Azote disponibles (Dixon et Pavia, 1995).

La méthode utilisée pour le dosage des tannins est basée sur la capacité des tannins à former des complexes insolubles avec la protéine BSA et de former des solutions colorées avec certains métaux.

Les résultats montrent la haute teneur de tannin dans l’extrait d’Urtica dioïca 12,18 mgEAT/gEB, par rapport à l’extrait méthanolique de Mentha rotundifolia qui contient une valeur moyenne 5,86 mg EAT/g EB. Cette différence des teneurs retrouvées dans différents

Mehanso et al., (1987) , ont montré que les concentrations en tannins varient largement au sien de la même espèce végétale selon le cultivar , l’âge de la plante et les caractéristiques de site de croissance. Selon Makkar et al., (2003), les tannins condensés augmentent avec la maturation des feuilles.

L’étude de l’activité antiradicalaire des deux plantes étudiée montre que Mentha rotundifolia

possède la plus forte activité antiradicalaire par le test au DPPH par rapport Urtica dioïca. De plus, ces plantes comprennent en leur sien, des composés phénoliques dont la teneur est on adéquation avec l’activité antiradicalaire traduite ici par les tests au DPPH. La forte activité antioxydant de Mentha rotundifolia serait donc liée à sa fort teneur en polyphénols totaux. Nos résultats sont en accord avec les travaux de Bidie et al., (2010). Selon ses auteurs les plantes qui possèdent une bonne activité antioxydantes contiennent de fortes teneurs en groupement phénoliques.

La différence de pouvoir antiradicalaire entre les échantillons est due probablement à la variation des espèces de plantes utilisées et à la teneur et la nature de leurs composés phénoliques.

Gulluce et al., (2007) on montré que l’extrait méthanolique de Mentha longifolia piège 50 % de radicale DPPH à une concentration de 0,057mg /ml ce qui est inférieure de nos résultats 83,55% à une concentration de 0,05mg/ml.

L’activité antioxydante des extraits de Mentha rotundifolia et Urtica dioïca a été évaluée en utilisant la méthode de FRAP. Cette dernière est un essai simple, rapide et reproductible. Elle est basée sur la capacité des extraits à réduire le fer ferrique Fe³⁺ en fer ferreux Fe^2+.

Notre résultat montre que Mentha rotundifolia enregistre le pouvoir réducteur le plus élevé par rapport à Urtica dioica. Cela est due vraisemblablement à leur teneur élevée en polyphénols totaux et la structure des composés phénoliques (en particuliers le degré et la position des groupements hydroxyles sur le noyau aromatique de la molécule) (Sharififar et al., 2009; Scherer et Gody, 2009).

En ce qui concerne l’évaluation de l’interaction extraite phénolique/ protéine pour l’effet de concentration des l’extraits, la variation des résultantes entre les deux plantes peut être attribuée à la nature de composition de leurs composés phénoliques. D’après les résultats des dosages, Urtica dioïca est l’espèce la plus riche en tannins. Cette plante a montré des interactions intenses par rapport à Mentha rotundifolia. Cela nous mène à conclure que les tannins sont responsables en majeur partie des complexes formés. En effet, plusieurs travaux ont

démontré que les tannins fixent les protéines et forment des complexes insolubles (Eagles et Wakeman, 2001; Vergé et al., 2002; Tirelli et De Noni, 2007).

Les tannins jouent nu rôle de ligand polydenté, ils s’associent avec les protéines par des interaction hydrophobiques et par des liaison hydrogènes (Hagerman et Butler, 1978; Xu et Diosady, 2002; Bennik, 2002; Vergé et al., 2002; Poncet-Legrand et al., 2006 ). Ces derniéres se forment entre les groupements hydroxyles des phénols et les groupements carbonyles des protéines (Yan et Bennick, 1995; Santos-Buelga et scalbert, 2000). D’après Tiziani et al.,

(2008), les tannins peuvent aussi former des liaisons ioniques, hydrogènes et parfois covalentes avec les groupements aminés et hydroxyles des protéines. Les complexes ainsi formés deviennent moins hydrophiles que la protéine elle-méme, ce conduit à la précipitation (Frazier et al., 2003; Richard etal., 2006).

Il a été rapporté que l’augmentation de la masse moléculaire, le degré de polymérisation et le nombre de groupements hydroxyles des composés phénoliques accroit l’affinité et favorise la précipitation avec les protéines (Siebert et al., 1996; Rawel et al., 2002; Tirelli et De Noni, 2007; Cosme et al., 2008).

Pour l’effet de la concentration de la protéine, la DO augmente et à une certaine concentration diminue. Les mêmes observations ont été rapportées par De Freitas et ses collaborateur (2003), en étudiant l’interaction polyphénols –BSA. D’après ces auteurs, l’addition progressive de la BSA provoque une dissociation des agrégats insolubles. Ceci peut s'expliquer par sa réversibilité des interactions polyphénols-protéines et par le changement stœchiométrique du complexe formé, à couse du changement du rapport entre polyphénols et protéines (De Freitas et al., 2003; Naczk et al.,2006).

En effet Sibert et al., (1996) et poncet-Legrand et al., (2006) ont montré que la quantité des complexes polyphénols protéines formés dépend des concentration de protéines , des polyphénols et du rapport entre les deux.

Pour l’effet de température, nous avons divisé l’évaluation de la turbidité des mélange (extrait de plantes /Ovalbumine), en fonction de la température en trios groupes, l’effet de température sur la formation des complexes polyphénols-protéines, s’avère non significative de 5à 25 C, puis on a remarqué une augmentation significative de 25°C° à 37 C, et enfin à plus des 37°C il y’a eu

Sundar Ghosh et ces collaborateur (2008) rapportent , qu’en présence de polyphénols avec un degré de polymérisation élevé, la température renforce les interaction hydrophobe, contrairement aux liaison hydrogènes qui diminuent avec l’augmentation de Température, ce qui explique l’élévation de la turbidité en appliquant des températures allant de 25°C à 37°C , ce qui mène à conclure que l'interaction entre les extraits des plantes étudiées et d'OVB est de type hydrophobe. Cette liaison se forme principalement entre les groupements galloyls, qui comportent plusieurs groupements hydroxyles des tanins et les cycles pyrrolidine des prolines (Vergé et al., 2002; Richard etal., 2006).

D'après Prigent (2005),la dénaturation de la protéine induit la diminution de sa surface totale et donc la diminution du nombre d'acide aminés exposés à la surface et donc les sites de liaisons des polyphénols.

Conclusion

L'industrie pharmaceutique utilise encore une forte proportion de médicaments d'origine végétale et les chercheurs trouvent chez les plantes des molécules actives nouvelles, ou des matières premières pour la semi synthèse. Parmi ces molécules, les polyphénols sont probablement les composés naturels les plus répandus dans la nature.

La présente étude avait pour objectifs le dosage des polyphénols totaux, des flavonoïdes et des tannins de deux plantes médicinales étudiées Mentha rotundifolia et Urtica dioïca, ainsi que évaluation de leurs activités biologiques à savoir l’activité antioxydante et l’interaction avec les protéines.

L’étude phytochimiques a prouvé la richesse des feuilles de l’espèce de Mentha rotundifolia en composés phénoliques totaux par rapport à l’espèce d’Urtica dioïca.

Il est claire, que les résultats de notre travail, nous paraissent d’emblée intéressants et apportent une validation à l’utilisation traditionnelle de ces espèce végétale.

Les polyphénols de Urtica dioïca et Mentha rotundifolia ont montré qu’elles sont dotées d’une activité antioxydante par deux méthodes, le test de DPPH et le teste réducteur de fer (FRAP). La première méthode indique la capacité des plantes étudiées à piéger ce radicale. Ce potentiel s’élève avec l’augmentation des concentrations des extraits de plantes ce qui peut refléter la quantité d’antioxydants présents dans les différentes échantillons. La deuxième méthode a montré que.l’extrait de Urtica dioïca posséde une capacité à réduire le fer similaire que celle de α -tocophérol.

Au cour de ce travail, une deuxième propriété biologique des composés phénoliques a été démontré par l’étude interactionnelles de l’OVB avec les extraits des deux plantes. Ces interactions sont fortement influencées par la variation des concentrations de l’OVB et des extraite phénoliques. Toutefois, une température inférieure à 25 °C n’a aucun effet statiquement sur la formation des complexes polyphénol-protéine, au-delà les interactions se renforcent dans le cas ou la protéine n’est pas dénaturée.

Ces résultats in vitro ne constituent qu’une première étape de recherche de produits antioxydants nouveaux et naturels à proposer en médecine.

Dans cette perspective et dans le but de compléter ct travail, il serait intéressant de procèdes à une caractérisation qualitative plus poussée, de ces extraits par la détermination des structures et propriétés chimiques de leurs composés phénoliques.

De même, une réflexion et des essais sur le mode d’utilisation de ces métabolites secondaires naturellement présents dans les plantes mérites d’être menés pour leur utilisation à la place de l’antioxydant de synthèses. Ces substances se substitueraient alors aux produits chimiques habituellement utilisés comme antioxydants.

Figure : Protocole général d’extraction des composés phénoliques 50 g de poudre Macération pendant 48 h Filtration (Whatman N° 3) Le filtrat Délipidation et décantation Phase hexanique Phase méthanolique

Evaporation à l’aide d’un rotavapeur à 40°C Jetée Jetée Hexane 500 ml de méthanol (80%)

Récupération de l’extrait brut aux concentrations désirées

Figure : Protocole de dosage des composés phénoliques

Figure : Protocole de dosage des flavonoïdes 0,2 ml de l’extrait (250µg/ml) 1,5ml de réactif Folin- Ciocalteu (1/10) 5 min à température ambiante et à l’obscurité 1,5ml de Na2CO3 (7,5%)

90 min à température ambiante et à l’obscurité

Figure : Protocole de dosage des tannins 1 ml de l’extrait à1mg/ml 1,5 ml d’extrait (2mg/ml) 2 ml de BSA (1mg/ml) 1,5 ml d’AlCl3 à 2% d’incubation pendant 24h à 4°C

Incubation pendant 30 min à température ambiante et à l’obscurité

Centrifugées pendant 20 min Lecture à 430 nm

Agité vigoureusement par le vortex

4 ml de SDS/TEA

Incubation pendant 15 min

1 ml de FeCl3

Figure : Protocole d’étude de l’activité antiradicalaire

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