DISCUSSION

A cor é uma característica que compõe a qualidade sensorial de produtos alimentícios no mercado, sendo de grande importância na aceitação do produto. Assim, as alterações de cor nas formulações são ilustradas na Figura 7.

Figura 7: Representação fotográfica das três formulações analisadas, F1, F2 e F3, respectivamente.

As amostras foram avaliadas em relação às coordenadas de cor, e os resultados são apresentados na Tabela 6.

Tabela 6. Coordenadas de cor obtidas para as três formulações de suco de cajá utilizadas na análise sensorial.

Formulação Coordenadas de cor

L* a* b*

F1 21,983 (0,010)a _{13,648 (0,053)}a _{22,645 (0,472)}a

F2 13,720 (0,213)b _{5,172 (0,904)}b _{10,662 (0,713)}b

F3 11,780 (0,465)c _{6,635 (0,818)}b _{10,470 (0,825)}b

abc_{Letras diferentes na mesma coluna indicam que há diferença estatística entre as} médias a 95% de confiança pelo teste de Tukey (p<0,05).

Quanto ao parâmetro luminosidade (L*), percebe-se que os valores diminuíram após a fermentação, tornando o suco mais escuro. Destaca-se que o suco fermentado e adoçado apresentou menor valor de L*. Neste sentido, a diferença significativa observada para L* entre os sucos fermentado pode ser justificada pela presença do adoçante estévia a 10%, que possivelmente contribuiu para redução da luminosidade na amostra adoçada.

Além disso, as coordenadas a* e b* diferiram significativamente entre os sucos controle (F1) e os fermentados (F2 e F3), confirmando que a fermentação de L. acidophilus no suco de cajá interferiu nestes parâmetros de cor.

Ao avaliar as coordenadas de cor do suco de abacaxi com juçara fermentado por L. rhamnosus GG, Campos et al.73_{, não observaram interferência na} luminosidade em relação ao suco controle (não fermentado), no entanto, a adição do probiótico foi capaz de alterar significativamente as coordenadas de cor a* e b*. Ademais, de maneira análoga ao observado em nosso estudo, Costa et al.79 relataram que a adição de L. paracasei promoveu escurecimento em suco de laranja, com consequente perda da cor amarela, comprometendo a aceitabilidade do produto pelos consumidores.

5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

O sobrenadante suco de cajá fermentado por L. acidophilus por 16 h foi submetido a ensaios in vitro para avaliação de seus efeitos inibitórios sobre o crescimento de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, bactérias oportunistas de relevância clínica por acometer pacientes pós-cirúrgicos e imunocomprometidos. A Tabela 7 descreve o percentual de inibição do crescimento microbiano obtido para o sobrenadante do suco de cajá fermentado com L. acidophilus.

Tabela 7: Atividade antimicrobiana do sobrenadante do suco de cajá fermentado por L. acidophilus durante 16 h.

Micro-organismo Inibição do crescimento (%)ª Staphylococcus aureus 44,5 (12,4)

Enterococcus faecalis NDb

Escherichia coli 35,0 (3,3)

Klebsiella pneumoniae 16,1 (0,9) a_{Resultado expresso em média (DP)}

b_{Não detectado}

Estudos anteriores relatam a atividade antimicrobiana de uma variedade de probióticos contra micro-organismos patogênicos80,81_{. É importante destacar, ainda,} que o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos têm motivado a pesquisa de novas alternativas antimicrobianas, das quais os probióticos ganharam um forte interesse. Neste sentido, o consumo de alimentos contendo Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. poderia auxiliar no combate de infecções microbianas e melhorar a saúde humana82_.

Os resultados encontrados no presente estudo, mostram que houve inibição de crescimento dos micro-organismos Staphylococcus aureus (44,5%) e Escherichia coli (35,0%), e menor inibição para Klebsiella pneumoniae (16,1%). Uma justificativa para atividade encontrada é a produção compostos como bacteriocinas, ácido lático e peróxido de hidrogênio por L. acidophilus83_.

Abdelhamid et al.81_{, avaliaram a inibição do crescimento de 6 linhagens de E.} coli por diferentes probióticos, incluindo L. acidophilus, que foi capaz de inibir 56,9% do crescimento. Nesse mesmo estudo, foram utilizados outros probióticos, como B. longum, B. bifidum, L. helveticus e L. rhamnosus, sendo observado que a inibição do crescimento variando de 48,62% a 57,94%.

No estudo de Hashemi et al.32 _{que utilizou o suco de limão para fermentação} de L. plantarum, foi observado um aumento da atividade antibacteriana durante a fermentação, mostrando assim, que as propriedades antibacterianas foram aceitáveis contra E. coli, e também contra S. typhimurium.

Koohestani et al.83_{, também demonstraram a atividade antimicrobiana de L.} acidophilus LA5 e L. casei 431 contra S. aureus. Foi avaliada pelo método da difusão em ágar por poço, e os resultados encontrados mostram que diâmetros das zonas de inibição de L. acidophilus foram de 50,26 mm e os de L. casei de 37,06 mm, ou seja, o L. acidophilus apresentou uma atividade antimicrobiana satisfatória para este micro-organismo.

De maneira similar aos resultados obtidos no atual estudo, Tejero-Sariñena et al.80 _{descreveram uma atividade antimicrobiana significativa de L. acidophilus} NCIMB 30184 contra E. coli e S. aureus. E, também, para E. fecalis, divergindo do resultado encontrado no presente estudo, visto que não foi detectado atividade antimicrobiana para este micro-organismo.

Em contrapartida, Mogna et al.84_{, em um estudo in vitro, avaliando a inibição} da K. pneumoniae por L. delbrueckii, observou que houve inibição do micro- organismo, diferentemente do que foi encontrado no atual estudo, onde para K. pneumoniae houve inibição leve. É sugerido que o maior efeito inibitório de L. delbrueckii pode ser atribuído a uma característica específica dessa linhagem, que é uma produção elevada de bacteriocinas.

Em outro estudo, testando a atividade antimicrobiana de diferentes linhagens de Lactobacillus sp. e antibióticos padrão contra micro-organismos uropatogênicos, Shim et al.85 _{demonstraram que os probióticos possuíam maior zona de inibição} quando comparados a alguns antibióticos, confirmando, assim, a sua eficiência antimicrobiana.

Portanto, os achados desta pesquisa revelam resultados positivos quanto a inibição do crescimento de micro-organismos patogênicos em diferentes proporções, corroborando com que é descrito na literatura sobre a capacidade antimicrobiana de micro-organismos probióticos.

5.5 ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DA BEBIDA FERMENTADA POR ATÉ 28 DIAS

Um dos grandes desafios no desenvolvimento de bebidas vegetais probióticas é fazer com que o micro-organismo mantenha a sua viabilidade e funcionalidade durante toda a vida de prateleira do produto. Neste estudo, a estabilidade microbiológica do suco de cajá fermentado com L. acidophilus, armazenado sob refrigeração (4 °C) foi avaliada por 28 dias. Os resultados são apresentados na Figura 8.

Figura 8: Estabilidade microbiológica da bebida fermentada durante armazenamento por 28 dias. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre as médias a 95% de confiança (p<0,05).

Os resultados mostraram que a contagem de células viáveis no suco de cajá caiu de 12,0 (0,1) Log UFC/mL no dia 0 para 9,3 (0,2) Log UFC/mL no dia 7, com o tempo de armazenamento influenciando significativamente a viabilidade de L. acidophilus nos primeiros 7 dias (p<0,05). Logo em seguida, a viabilidade se manteve estável nos dias 14, 21 e 28, com uma contagem de 8,7 (0,7) Log UFC/mL no final do período.

É importante destacar que contagem permaneceu acima de 6,0 Log UFC/mL durante todo o período de armazenamento, o que corresponde a uma quantidade superior a 106 _{UFC/mL, o valor mínimo exigido pela legislação para leites} fermentados86_{. Esse valor foi usado como referência para o suco produzido neste} trabalho, em virtude da inexistência de parâmetros específicos para sucos fermentados.

A fruta escolhida para elaboração de sucos fermentados apresenta forte influencia na viabilidade inicial e final de estoque do produto. Em pesquisa, com metodologia similar, avaliando estabilidade por 28 dias no suco de jujuba (Ziziphus jujuba Mill.) fermentado com L. rhamnosus GG e L. plantarum, inicialmente foi observado um ligeiro aumento da contagem de células viáveis para 9,2 Log UFC/mL e após 28 dias houve uma diminuição para 8,4 Log UFC/mL87_.

Alguns autores sugerem que essa diminuição na contagem celular, pode estar ligada às condições desfavoráveis de pH e alto grau de acidez durante a estocagem87_{.No entanto, no presente trabalho esse efeito foi minimizado, uma vez} que o pH oscilou entre 6,63 e 6,95 durante toda a fermentação.

Por outro lado, a baixa temperatura empregada inicialmente na refrigeração, poderia ser um fator de estresse para a célula microbiana, constituindo-se num fator limitante da manutenção da viabilidade do micro-organismo. Entretanto, após esse estresse inicial pode-se observar que a temperatura promoveu a manutenção da viabilidade da bebida probiótica na temperatura de 4 ºC.

Em uma pesquisa, a estabilidade de nove linhagens do gênero Lactobacillus em uma bebida de fruta com pH de 4,2 estocada a 4 ºC foi avaliada por até 80 dias, com L. plantarum demonstrando a melhor viabilidade após período de armazenamento refrigerado e L. acidophilus com a menor viabilidade ao final dos 80 dias88_{. Após a avaliação da estabilidade de uma bebida derivada do leite e em um} suco de cenoura, por 20 dias, foi observado que as linhagens de L. acidophilus e L.

plantarum não perderam viabilidade significativa durante este período em ambas as matrizes89_.

Igualmente, no suco de caju fermentado por L. casei NRRL-442, foi observado que no início do armazenamento, houve uma alta concentração de células viáveis de 8,63 (0,04) Log UFC/mL até ao 28º dia de armazenamento a 4 °C. A partir do 35° dia, houve uma ligeira redução da contagem de células viáveis para 8,53 (0,05) Log UFC/mL. Apesar dessa redução na viabilidade no final do período de armazenamento, a contagem de células viáveis de L. casei foi sempre superior a 8,00 Log UFC/mL, o que é um bom valor para produtos fermentados contendo probióticos41_.

Em um estudo utilizando o cacau como matriz para a fermentação de bactérias do ácido lático, e avaliando sua estabilidade refrigerada a 4 o_{C por 42 dias,} foi observado que viabilidade do suco probiótico com adição de sacarose aumentou de 8,76 (0,05) Log UFC/mL, no início da armazenagem para 8,99 (0,02) Log UFC/mL, no dia 21. E então, a partir do dia 28, ocorreu redução da viabilidade para 7,52 (0,01) Log UFC/mL até 42 dias90_.

5.6 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 EM CONDIÇÕES GASTROINTESTINAIS SIMULADAS

Outro requisito imprescindível para um alimento probiótico é que a estirpe seja capaz de sobreviver às condições do trato grastrointestinal (TGI), tolerando pH ácido, ação de enzimas digestivas e sais biliares73_{. Para avaliar a sobrevivência do} micro-organismo em condições gastrointestinais simuladas bem como sua adequação a matriz, a viabilidade de L. acidophilus foi analisada in vitro utilizando o suco recém-fermentado e após 28 dias de armazenamento sob refrigeração.

Figura 9: Viabilidade celular L. acidophilus NRRL B-4495 em condições gastrointestinais simuladas no armazenados sob refrigeração no suco recém- fermentado e no suco após 28 dias de armazenamento. Letras iguais indicam que não há diferença estatística entre as médias a 95% de confiança (p<0,05).

A sobrevivência de L. acidophilus no suco submetido às condições gastrointestinais simuladas é mostrada na Figura 9. O ensaio in vitro foi analisado para as fases gástrica I (60 minutos), gástrica II (120 minutos), entérica I (180 minutos) e entérica II (240 minutos).

Ao avaliar o comportamento do probiótico nas diferentes fases, verificou-se que para o suco recém-fermentado, a viabilidade da cultura probiótica antes da exposição ao estresse gástrico não diferiu (p<0,05) da viabilidade da fases gástricas e intestinais. No entanto, o suco refrigerado pelo período de 28 dias apresentou contagens de células viáveis para as fases entéricas I e II, significativamente menores (p<0,05), caindo de 11,78 Log UFC/mL (0,03) no tempo 0 para 11,58 Log UFC/mL (0,0) e 11,55 Log UFC/mL (0,05) respectivamente (Figura 8).

Apesar da redução estatisticamente significativa do probiótico refrigerado nas condições intestinais simulada para a bebida armazenada por 28 dias, é importante destacar que a contagem de células viáveis ainda permaneceu acima de 6,00 Log UFC/mL, para fornecer os efeitos benéficos, segundo preconiza a legislação para leites fermentados e estudos da área86_.

Os resultados encontrados corroboram com a afirmação de que a matriz carreadora exerce ação sobre a estirpe probiótica durante a passagem pelo trato gastrointestinal. Desta forma, a fermentação realizada em suco de cajá pode ter possibilitado uma adaptação do microrganismo à matriz carreadora, o que também pode ter favorecido a manutenção da contagem de células viáveis, mesmo em condições adversas.

Em um estudo, onde também foi avaliado a sobrevivência de espécies de Lactobacillus em condições gastrointestinais simuladas, foi observado um resultado positivo. As bactérias probióticas investigadas exibiram uma viabilidade muito boa contra ambas as tensões: 0,3% de pepsina e 0,6% de sais biliares. Apenas uma perda de 0,01 Log UFC/mL foi detectada após o tratamento com 0,3% de pepsina por 135 minutos77_.

Outros estudos com metodologia similar, utilizando linhagens diferentes de Lactobacillus spp. também descrevem a resistência de bactérias probióticas aos estresses gástricos, mantendo-se viável em contagens satisfatórias em todo trânsito gastrointestinal88,91_.

Em pesquisa realizada por Ortakci et al.92_{, também com a espécie L.} acidophilus, foi observada diminuição da viabilidade celular após 30 minutos de exposição do micro-organismo às condições gastrointestinais simuladas, com a diminuição numérica de 109 _{para 10}6_.

Diante disto, conclui-se que os achados no presente estudo demonstram que a viabilidade do probiótico foi satisfatória sob condições simuladas de digestão,

indicando o potencial do produto em atingir o lúmen intestinal e exercer benefícios a saúde do hospedeiro.