Les reproductions expérimentales confirment le caractère transmissible de la maladie avec un tableau nécropsique compatible avec celui obtenu par les autres auteurs (Bernarth et Szalai 1970 , Schettler 1980 ; Sans 1992).
La purification du virus aboutit à des fractions riches en virions de 40 à 50 nm de diamètre, non-enveloppés, de faible densité; leur affiliation au groupe des « papova-like » d'après ces critères morphologiques semble dès lors pertinente, mais doit être considérée avec précaution en raison des risques d’artefact de coloration.
L’adaptation à la culture cellulaire avait été tentée, sans succès, sur œufs embryonnés et fibroblastes d’embryons (Vuillaume, 1993). Nous avons pu cultiver le virus de la NHEO sur des cellules épithéliales de reins d'oisons. Dans les cellules infectées, les virions sont rassemblés dans le noyau, ce qui évoque une réplication intranucléaire et donc un virus dont le génome est un ADN. Les antigènes viraux sont révélés avec du sérum d’oisons issus d’oies reproductrices ayant subies un épisode de NHEO pendant leur phase d’élevage, ce qui confirme le lien entre le virus cultivé et l’agent de la maladie sur le terrain. L’examen en microscopie électronique confirme la présence de virions en grand nombre dans le noyau et révèle des vacuoles cytoplasmiques atypiques. Notons que nous n’avons pas pu amplifier le virus de la NHEO sur fibroblastes d’embryon d’oie, alors que ce type cellulaire est particulièrement indiqué pour la culture des polyomavirus aviaires (Bozeman et al., 1981).
La stratégie moléculaire adoptée reposait sur l’amplification aléatoire des acides nucléiques présents dans les fractions «purifiées»; l'efficacité de cette approche dépend de la richesse relative en acide nucléique viral et en éventuels contaminants; notre succès s'explique donc largement par l'obtention d'un matériel viral abondant après purification. La mise en évidence d’une séquence « virale » nécessite ensuite la confirmation du lien entre la séquence et l’agent étiologique. La difficulté possible dans cette phase tient au fait que des animaux peuvent être porteurs sains (le virus peut être beaucoup plus prévalent que la maladie). Comme il n’existe pas d’oisons « EOPS », les travaux expérimentaux ont été réalisés sur des oisons conventionnels, dont on ne connaissait pas a priori le statut sanitaire. Dans le cas présent, nous avons pu montrer la stricte association entre la séquence du polyomavirus et l’agent infectieux, que ce soit sur les tissus d’oisons infectés spontanément ou expérimentalement, ou les cultures cellulaires infectées.
L’analyse génétique de l’agent de la NHEO a permis de le classer dans le genre Polyomavirus. Ce résultat est parfaitement cohérent avec les autres éléments accumulés au cours de ce travail : petit virus non enveloppé, de 45 à 50 nm de diamètre, à réplication intranucléaire, résistant à la chaleur (Shah, 1996 ; Van Regenmortel, 2000). Sur cette base, nous avons proposé pour cette nouvelle espèce virale la dénomination Goose hemorrhagic polyomavirus (GHPV), qui est conforme avec les règles de la nomenclature virale et évite la confusion avec le GPV (Goose parvovirus), le parvovirus agent de la maladie de Derszy chez l’oie.
La forte divergence génétique entre le GHPV et le BFDV (identité nucléotidique de 59 %, similarité de 72 %) montre que le GHPV est bien une espèce à part entière et non un variant du BFDV; cette divergence explique d’ailleurs que les amorces spécifiques des polyomavirus aviaires utilisées au départ (Phalen et al., 1991) n’aient pas permis d’amplifier l’ADN du GHPV.
Les polyomavirus sont largement distribués chez les mammifères et les oiseaux, et sont généralement adaptés de manière spécifique à leur hôte (Shah, 1996). Les polyomavirus aviaires ont été identifiés à partir de diverses espèces de psittacidés (Ritchie, 1991). Le polyomavirus aviaire prototype est le BFDV (Budgerigar Fledgling Disease Virus), agent d’un syndrome fulgurant chez les jeunes perruches (Bozeman et al., 1981, Müller, 1986, Ritchie, 1991), évoquant par certains aspects la NHEO. Des virus apparentés ont été isolés chez d’autres psittacidés et des oiseaux sauvages, comme les passereaux et les falconidés (Graham, 1987, Johne, 1998, Phalen, 1999). A ce jour, aucun n’avait été associé à une affection des volailles. Un point commun des polyomavirus aviaires est leur pouvoir pathogène intrinsèque : cette propriété contraste fortement avec la biologie des polyomavirus de mammifères qui sont le plus souvent associés à un portage asymptomatique, qui peut être très long (Shah, 1996, Zur Hausen, 1979). Le GHPV se multiplie sur Lymphocytes B (LB) , si l’on se réfère à la lyse lymphocytaire de la medulla de la bourse de Fabricius. Ce tropisme privilégié pour les LB est aussi décrit chez les virus BK, JC (polyomavirus de mammifères) et BFDV (polyomavirus aviaire). L’analyse histologique montre que le GHPV comme le BFDV présentent un spectre cellulaire plus large que les polyomavirus de mammifères, dont la réplication se limite à quelques types cellulaires, voire aux seuls LB (cas du Lymphotropic polyomavirus, isolé chez le singe vert).
Cependant l’agent de la NHEO présente des propriétés biologiques originales, en particulier l’absence d’inclusions basophiles intranucléaires typiquement associées à la réplication des polyomavirus : ceci explique en partie que l’identification de ce virus ne soit intervenue que 30 ans après la première description de la maladie. Les variants du BFDV sont par ailleurs
caractérisés par leur large spectre d’hôte (Phalen et al., 1999), ce qui contraste avec l’apparente spécificité du virus NHEO pour l’oie (Sans, 1992). Ce point est en cours d’investigation, notamment en ce qui concerne les autres palmipèdes, pour évaluer leur rôle éventuel dans le portage et la circulation du virus. La pathogénicité de tous les polyomavirus aviaires reflète une caractéristique commune au niveau moléculaire. A travers les différents variants du BFDV, des mutations ponctuelles ont été observées sur les 2 gènes de capside VP2 et VP3. Ces mutations expliqueraient les différences histopathologiques et même la spécificité du spectre d'hôte.
Les travaux de recherche menés à l'ENVT avaient pour objectifs d'isoler et identifier clairement l'agent de la NHEO; d'adapter ce virus sur un système cellulaire, se dispensant ainsi de la purification virale à partir d'organes qui est lourde et fastidieuse. L’amplification génomique d’un fragment de 144 paires de base à l’aide d’amorces spécifiques constitue à ce stade un outil diagnostique susceptible d’identifier un portage asymptomatique ou de confirmer une suspicion clinique; dès lors les perspectives de recherche s'élargissent :
• Prévention de la NHEO par des mesures sanitaires :
Sur le plan de la maîtrise sanitaire de l’infection naturelle, le GHPV est un virus très résistant dans le milieu extérieur : il résiste à une température de 55°c pendant une heure, les solvants des lipides ne l'inactivent pas et il ne craint pas la dessiccation. Sachant aussi qu'il existe un portage asymptomatique des animaux ayant survécus à un épisode de NHEO, les protocoles de nettoyage-désinfection rigoureux et adaptés avec respect stricte du vide sanitaire doivent d'emblée être scrupuleusement respectés ; les dérivés chlorés semblent des désinfectants de choix pour inactiver efficacement le virus (Ritchie et al., 1993).
Le contrôle de la NHEO sur le terrain ne peut pas être fondé uniquement sur la détection et l’éradication des lots porteurs du virus, car l’incidence de la maladie est actuellement très forte et les premiers résultats montrent une forte circulation virale dans les élevages. La seule solution acceptable dans la situation actuelle repose sur la vaccination.
• Prophylaxie médicale de la NHEO :
La vaccination de troupeaux de reproducteurs avec un vaccin inactivé et adjuvé induit la production d’anticorps passifs neutralisants et protecteurs chez le jeune oison. Cette vaccination a donc a priori toutes les chances de protéger un oison contre une infection naturelle dans la période du démarrage. D'ailleurs cette approche semble à priori la plus pertinente et la seule envisageable d'un point de vue pratique. Il sera peut-être nécessaire d’envisager une vaccination « relais » des oisons prêts à gaver pour assurer une protection pendant toute la durée de vie économique des oies prêtes à gaver.
Le recours à la vaccination doit donc être conçu comme un outil d’urgence, d’utilisation ciblée, destiné à permettre à terme l’application de mesures de contrôle essentiellement fondées sur la prophylaxie sanitaire, lorsque la prévalence de l’infection aura décru de manière significative. En toute hypothèse, il est clair qu’un éventuel vaccin ne devra être considéré que comme un des outils de la maîtrise sanitaire, et ne saurait se substituer au respect des règles d’hygiène, qui doivent dès à présent s’appliquer avec une grande rigueur, tant en multiplication qu’en production.
• Précision sur l'épidémiologie :
La connaissance fine de l’épidémiologie de la NHEO est un autre enjeu à relever : elle conditionne la pertinence et l’efficacité d’une stratégie globale de maîtrise de la maladie. La mise au point d'un test sérologique de type ELISA permettra de déterminer le statut de chaque élevage afin de limiter par les précautions mises en œuvre et au besoin par la vaccination, la propagation du virus à l'intérieur de l'élevage mais aussi à l'extérieur.
Outre la détermination des modes de transmission du virus (horizontale et / ou verticale ?), des recherches de portage du virus sur les espèces telles que le canard domestique, le canard et l'oie sauvages sont engagées, pour identifier d’éventuels réservoirs du virus.
Ce présent travail constitue donc une première étape dans la maîtrise globale de la N.H.E.O. D’autres contributions permettront de mieux cerner les nombreuses zones d’ombre qui demeurent...
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Page Figure 1 : schématisation du système prêt à gaver (PAG) 4 Figure 2 : position caractéristique de l’oison mort de NHEO 15 Figure 3 : photo de l’ascite et de l’ œdème gélatineux 15 Figure 4 : photo de l’entérite hémorragique avec foyers de nécrose 15 Figure 5 : protocole de purification du virus à partir d’organes 21 Figure 6 : schéma de purification du virus NHEO à partir d’organes 22 Figure 7 : schéma de purification du virus NHEO à partir de la culture cellulaire 25 Figure 8 : particules virales visibles en microscopie électronique (x 150000) 32 Figure 9 : cellules rénales infectées visualisées en immunofluorescence indirecte 32 Figure 10 : cellules rénales en culture, infectées par le virus NHEO, observées en
microscopie électronique 32
Figure 11 : amplification de l’ADN viral par PCR 34
Figure 12 : arbre phylogénétique sur la base VP1 du GHPV et d’autres polyomavirus 36
Tableau 1 : lésions observées sur les animaux inoculés dans le cadre du protocole • 29 Tableau 2 : reproduction expérimentale de la maladie par inoculation des 4 fractions
purifiées lors du protocole‚ 30
Tableau 3 : reproduction expérimentale par inoculation de broyats d'organes, de lysats
cellulaires et test de résistance du virus à la chaleur 33 Tableau 4 : comparaison globale de la séquence en aminoacides de la VP1 du virus
NHEO et de 7 autres polyomavirus 35
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Toulouse, 2002
NOM : DUBOIS Prénom : LUC
TITRE : ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DU POLYOMAVIRUS AGENT DE LA NEPHRITE HEMORRAGIQUE ENTERITE DE L’OIE (N.H.E.O.)
RESUME:
L’agent de la Néphrite Hémorragique Entérite de l’Oison (NHEO) a été identifié. Sévissant de façon épizootique dans toutes les régions françaises productrices d'oie, son étiologie est restée jusqu'à maintenant inconnue. Nous avons reproduit expérimentalement la maladie en inoculant à des oisons d'un jour un broyat d'organes issus d'oies mortes sur le terrain des signes de NHEO. L'examen au microscope électronique de la suspension de virus purifié nous a permis de mettre en évidence des particules virales non enveloppées, sphériques, de 45 à 50 nm de diamètre évoquant par leur aspect morphologique le groupe des « papova-like ». Le virus a également été adapté à la culture sur cellules épithéliales de reins d’oison. Le virus purifié à partir d'organes ou à partir de la culture cellulaire reproduit la maladie, démontrant ainsi qu'il est responsable du pouvoir pathogène. L'amplification de l'acide nucléique viral par PCR à l’aide d’amorces aléatoires produit un fragment de 1175 paires de bases, correspondant à un polypeptide présentant 63 à 72 % de similarité avec la protéine majeure de la capside des polyomavirus (VP1). Nous proposons donc pour le virus de la NHEO la dénomination Goose hemorrhagic polyomavirus (GHPV).
MOTS-CLES :VOLAILLE - OIE– MALADIE VIRALE – POLYOMAVIRUS
TITLE : ISOLATION AND IDENTIFICATION OF THE POLYOMAVIRUS AGENT OF HEMORRHAGIC NEPHRITIS ENTERITIS OF GEESE (H.N.E.G.)
SUMMARY:
We have identified the etiological agent of Hemorrhagic Nephritis Enteritis of Geese (HNEG). HNEG has been recognized in almost all goose breeding areas, with an epizootic pattern, and up to now, the infectious agent had remained unknown. Infected tissues from HNEG-affected geese were inoculated to 1-day-old goslings, which then developed clinical signs typical of HNEG. Tissue homogenates from these birds were subjected to purification : lipid extraction, sucrose density gradient ultracentrifugation. The resulting main band was examined by electron microscopy and consisted of spherical, naked, papovavirus-like particles approximately 45 nm in diameter. The virus was isolated and propagated in goose kidney cell primary culture. Tissue- or culture-purified virus allowed the experimental reproduction of the disease in goslings. Random PCR amplification of viral nucleic acid produced a 1,175-bp fragment which was shown to be associated with field samples collected from geese affected by HNEG on commercial farms in France. Sequence phylogenetic analysis of the PCR product showed 63 to 72 % amino acid similarity with the major capsid protein (VP1) of several polyomaviruses. We thus have named this newly identified virus Goose hemorrhagic polyomavirus.