Production et purification de VEMB de Salmonella Enteritidis SHY-04-1540
Au cours de cette maîtrise, une grande partie des efforts a été consacrée à assurer la qualité et la reproductibilité des diverses productions de VEMB de Salmonella Enteritidis SHY-04- 1540. Il était en effet de première importance qu’un soin particulier soit apporté à la purification des VEMB en vue des essais ultérieurs sur celles-ci, comme par exemple, pour des études de protéomique du contenu des VEMB ou des essais in vivo de leur efficacité vaccinale. Dans ce dernier cas, il deviendra possible d’attester de façon fiable, le niveau d’efficacité des VEMB à générer une réponse immunitaire et à conférer une protection vis-à- vis d’une infection à Salmonella.
Au début du projet, nous avons voulu établir divers protocoles de production des VEMB : en conditions normales de croissance de la bactérie (sur milieu LB) ainsi que sous stress, en accordant une importance particulière à la purification des VEMB produites.
La croissance de la souche Salmonella Enteritidis SHY-04-1540, sur milieu LB a été suivie pendant plus de 12 h, tandis que sur le milieu TSB elle n’a été suivie que 8 h. En effet dans le cas du TSB, notre intérêt était d’identifier la phase exponentielle pour procéder à l’ajout de l’antibiotique au milieu de cette phase de croissance et ce, dans le but de reproduire, à titre de contrôle, ce qui avait était fait par Alaniz et col avec Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (Alaniz et al., 2007). Nous avons observé que la souche a atteint la fin de la phase exponentielle plus vite sur le milieu TSB que sur le milieu LB. À température et vitesse d’aération similaires, la souche sur le milieu LB a pris 90 min de plus que dans le milieu TSB pour terminer sa phase exponentielle de croissance. Ceci est cohérent compte tenu de la quantité plus importante de nutriments qu’offre le TSB, tels que le dextrose (source
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d’énergie), la tryptone (digestion pancréatique de caséine) et la soytone (digestion peptique de de soja).
Pour le protocole sous stress antibiotique, avec la gentamicine à une concentration finale de 50µg/mL et administrée au milieu de la phase exponentielle de croissance sur le milieu TSB, nous avons identifié que le rapport entre la CMI des souches, Salmonella Enteritidis SHY-04- 1540 et Salmonella Typhimurium ATCC 14028, correspond à 200 et 125 fois la CMI, respectivement. Le résultat de la CMI de la souche contrôle Salmonella Typhimurium ATCC# 14028 correspond à ce qui a été obtenu par Swenson et al. avec la même souche (Swenson, Stewart, Hammett, Fitzsimmons et Ginsberg, 1990).
Quant au stress exercé sur la croissance de la souche sur un milieu acide avec peu de nutriments (AMM), nous avons pu observer une diminution de la population, comparativement à la croissance en milieu normal et ce, tout le long de la phase exponentielle de croissance d’au moins un log10. La terminaison de la phase exponentielle (atteinte sur les
deux milieux après 330 min) montre une population viable sur le milieu AMM de 2.13x108
UFC/mL, qui est inférieure à celle de la population viable de la souche en conditions normales sur milieu LB (1.66 x109 UFC/mL).
Bien qu’il soit possible d’obtenir des quantités plus importantes de VEMB dans des conditions de culture « stressantes » (Manning et al. 2011, Kulp et al. 2010. Ellis et al. 2010) nous avons privilégié la production des VEMB dans des conditions normales pour plusieurs raisons, dont une de reproductibilité, compte tenu que l’impact de l’agent stressant pouvait être difficile à contrôler. De plus, il a été montré que les conditions de croissance sont de facteurs qui affectent la composition des VEMB (Kulp et Kuehn, 2010). Il a aussi été démontré que les VEMB produites par stimulation de la bactérie avec un antibiotique peuvent intégrer des
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molécules d’antibiotique (Kadurugamuwa et Beveridge, 1997). Ce qui pourrait possiblement contribuer au problème de résistance aux antibiotiques.
La reproductibilité des caractéristiques du produit final a aussi été notre fil conducteur et notre priorité tout au long du projet. Ce facteur est d’autant plus important que le contenu en protéines, dont les protéines immunogènes, des VEMB est spécifique de paramètres précis, comme les conditions de croissance (milieu, pH, température, vitesse d’aération de la culture) (Collins, 2011). Il est aussi attendu que ce contenu protéique dépend de la phase de croissance (latence, croissance exponentielle etc.) à laquelle la production des VEMB est effectuée (McCaig, Koller et Thanassi, 2013).
Une connaissance précise de la courbe de croissance de la souche SHY-04-1540 était donc essentielle aux étapes subséquentes de production et d’isolement des VEMB. En particulier, nous avons étudié et reproduit à trois reprises, la courbe de croissance précise de la population bactérienne au cours du temps, avec l’identification (DO correspondante à la population viable) des phases de croissance dans des conditions de culture bien définies (milieu, température, etc.). Nous avons finalement choisi de produire les VEMB à une DO de 1,2, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, afin de maximiser la production de VEMB. Une production à une DO de 0,6 par exemple (milieu de la phase exponentielle de croissance) génère moitié moins de VEMB qu’à 1,2, sans toutefois courir le risque de dégradation protéique qui pourrait subvenir à la phase stationnaire de croissance qui suit la phase exponentielle.
Observation des VEMB de Salmonella Enteritidis SHY-04-1540 par MET
Les images obtenues en microscopie électronique à transmission (Voir figure 12) ont clairement démontré que les structures obtenues selon nos procédures, sont des VEMB de
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Salmonella Enteritidis. L’aspect soit une structure essentiellement sphérique et l’évaluation de
leur taille est en accord avec ce qui est décrit dans la littérature, à savoir des nanostructures de 50 à 250 nm de diamètre, sphériques et séparées de la paroi cellulaire bactérienne (Kulp et Kuehn, 2010). Ces images ont permis de déterminer la localisation des VMEB dans les diverses bandes du gradient de densité mis en œuvre pour leur purification. Les VEMB se sont retrouvées à une densité de flottaison entre 1,14 à 1,21 (fractions 26, 28, 30 et 40 %). Cette distribution est en accord avec des purifications de VEMB provenant d’autres bactéries à Gram négatif où les VEMB se sont retrouvées à une densité de flottaison entre 1,13 et 1,15 g/mL (Axis-Shield, 2011).
Sur ces images, compte tenu de l’absence de structures parasites, le degré de purification des VEMB semble excellent.
Migration des VEMB de Salmonella Enteritidis SHY-04-1540 sur gel SDS-PAGE
Dans le but de comparer les protéines des VEMB aux protéines totales et aux protéines de membrane externe de SE SHY-04-1540, nous avons procédé à l’extraction de ces dernières. Nous avons vu que le contenu protéique des VEMB, soit 0,226 mg provenant d’un litre de culture, est plus de 600 fois inférieur au contenu protéique total de la bactérie SE SHY-04- 1540 soit 137,28 mg pour un litre de culture de la bactérie. Ces résultats sont cohérents avec la différence de taille entre les VEMB et la bactérie d’où proviennent les protéines quantifiées. La migration sur SDS PAGE, (figure 13) montre des bandes de poids moléculaires (PM) similaires, entre 12 et 52 kDa, dans les VEMB, les protéines de membrane externe ainsi que dans les protéines totales de Salmonella Enteritidis SHY-04-1540. Cho a retrouvé (Cho et al., 2015) des bandes dans le même intervalle de poids moléculaires, qui correspondaient à OmpA de PM entre 28 et 38 kDa, Dps de PM entre 18,42 et 19,72 kDa, protéine W de la ME
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(OmpW) de PM 22,59 kDa . Ces protéines ont été trouvées (migration sur SDS-PAGE) et identifiées comme étant des protéines abondantes et immunogènes chez une souche de
Salmonella Enteritidis d’origine aviaire. Aksakal a comparé les bandes de protéines totales de
35 souches de Salmonella pour les suivants serotypes: Enteritidis, Typhimurium, Agona, Corvallis, Virchow, Augustenborg, Anatum, et Saintpaul, et a retrouvé des bandes communes entre 24 et 78,1 kDa, avec prédominance des bandes de 51,2 et 41,5 kDa (Aksakal, 2010). Cependant, des études complémentaires sont nécessaires afin d’identifier clairement les bandes, ainsi que d’examiner l’efficacité de ces protéines dans la protection contre l’infection à SE dans un modèle animal.
Rendement de protéines des VEMB
À ce jour, les données relatives au rendement des VEMB sont quasiment inexistantes dans la littérature. Seul un groupe de chercheurs a publié la quantité de protéines obtenue des VEMB de Francisella novicida. À partir d’un litre de culture cette quantité a été de 0,125 mg (McCaig et al., 2013). Bien que le rendement que nous avons obtenu ait été plus élevé, il est raisonnable de considérer la possibilité de l’améliorer.
LPS et VEMB
L’observation du LPS de Salmonella Enteritidis SHY-04-1540 sur gel SDS-PAGE (figure 14), montre plusieurs bandes de poids moléculaires entre 17 et 24 kDa. Ce résultat corrobore ce qui a été observé pour du LPS de SE très pure (macromolécules de 10-24kDa)(Sigma, L6011). La quantité de LPS des VEMB mis sur gel n’est pas suffisante pour faire une comparaison avec le LPS de la bactérie. Selon la littérature, la qualité du LPS des VEMB peut être différente de
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celle de la bactérie. Par exemple chez P.aeruginosa, seule une bande B du LPS a été retrouvée dans les VEMB (Kadurugamuwa et Beveridge, 1995).
La quantité de LPS contenue dans les VEMB (lors d’utilisation comme produit vaccinal) est un facteur important dans la mesure où le LPS peut-être, selon la dose administrée, un stimulant de la réponse immunologique, mais en même temps le LPS peut aussi provoquer une réaction inflammatoire (endotoxinique) avec fièvre et anorexie, si la quantité administrée est trop élevée (Keestra et van Putten, 2008).
Le contenu protéique des VEMB est considéré comme un indice de la teneur en LPS. La quantité relative de LPS est évaluée à 25 -50% de la quantité des protéines des VEMB (Holst et al., 2009). Nous avons effectivement trouvé un rapport de 26% (0,06 mg de LPS pour 0,226 mg de protéines).
Il est par ailleurs connu que pendant l’élevage, une poule est exposée à une quantité de 1 µg de LPS présentes dans les poussières de son environnement et ce, par jour (Parmentier, Klompen, De Vries Reilingh et Lammers, 2008).
Dans le but d’évaluer les VEMB que nous avons produites, un essai in vivo peut être fait, et pour estimer la dose à administrer lors de cet essai, nous pouvons nous appuyer sur diverses études in vivo menées chez les oiseaux, qui ont abouti à une dose consensus considérée comme acceptable (c'est-à-dire ne provoquant pas de réactions adverses) de 1 µg de LPS/gramme de poids de poussin, ce LPS étant administré par voie orale/intranasale (Parmentier et al., 2008; Ploegaert et al., 2007).
En prenant la dose la plus sécuritaire, c'est-à-dire en se basant sur l’estimation que le LPS des VEMB représente 50% de la teneur en protéines, il serait possible d’administrer 2 µg (en termes de contenu protéique) de VEMB par gramme de poussin.
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En considérant qu’un poussin SPF (Specific pathogen-free) pèse en moyenne 50 g lors de l’éclosion et que les poussins sont habituellement immunisés au couvoir, la dose vaccinale à administrer serait au maximum de 100 µg de protéines de VEMB, l’objectif d’administrer cette dose serait simplement de voir s’il y a une réponse immunitaire. Dans un deuxième temps l’ajustement de la dose serait fait.
Il ressort que l’amélioration du rendement de la production de purification des VEMB doit être faite. Des possibilités sont d’augmenter la population de la culture de départ (enrichir le milieu) et de reconsidérer les étapes de purification et de lavages subséquents de façon à minimiser les pertes de produit à chacune de ces étapes. En particulier, une filtration à 0.45 µm (au lieu de 0.2 µm) devrait améliorer le rendement de VEMB, car celles de VEMB de plus grandes tailles risquent moins d’être arrêtées par le filtre.
La production, l’isolement et la purification de VEMB réalisés par notre équipe est intéressante à plusieurs points de vue. Nous sommes les premiers à la Faculté de médecine vétérinaire de l’Université de Montréal, à avoir standardisé un protocole, reproductible, de production de VEMB, ce qui ouvre des possibilités et de l’intérêt pour d’autres étudiants à poursuivre la recherche associée aux VEMB : protéomique, vaccins, biologie bactérienne, etc…
Conclusion
Le but de cette étude était la production, la purification et la caractérisation des VEMB de la souche Salmonella Enteritidis SHY-041540.
-Production des VEMB: Après avoir testé trois protocoles différents de production de VEMB avec succès (conditions normales de croissance de la bactérie et sous conditions de stress), nous avons décidé de choisir le protocole de production en conditions normales de croissance de la bactérie, afin d’éviter l’introduction de variations, dans la composition des VEMB, causées par des agents stresseurs. Une fois choisi le protocole de production nous avons procédé à l’étape de purification.
-La purification des VEMB a été faite par gradient de densité à l’aide du milieu OptiprepTM, dans ce gradient de densité, nous avons retrouvé quatre couches enrichies en
VEMB, correspondant à un intervalle de densité de flottaison de milieu de 1,142 à 1,215(Axis- Shield, 2011).
-Caractérisation des VEMB : Les images de MET réalisées avant l’étape de purification et à partir des productions de VEMB suivant les trois protocoles, ont montré des vésicules de tailles variées (entre 17 et 67 nm), tailles qui sont dans les limites rapportées dans la littérature. Dans les images, avant l’étape de purification, on trouve des artefacts contaminants qui peuvent être des fragments bactériens. Ceux-ci semblent être absents après la purification par gradient de densité.
Le profil de protéines et du LPS par électrophorèses SDS PAGE a été fait sur une quantité insuffisante de matériel, la comparaison avec les protéines et le LPS de la bactérie reste donc à être étudiée.
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Comme vous pouvez le constater, les résultats des gels SDS PAGE nous montrent seulement la présence de protéines, ci qui est normal et attendu. La suite à donner, avant un essai in vivo, serait de vérifier si ces protéines des VEMB sont reconnues par des sérums identifiés protecteurs, d’animaux infectés naturellement et/ou immunisés avec Salmonella Enteritidis, par western blot. Une analyse subséquente, par spectrométrie de masse, des bandes obtenues permettrait finalement d’identifier les protéines immunogènes des VEMB de la souche
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