En utilisant le modèle de microperçage chez le lapin, des études précédentes ont démontré les bénéfices du chitosan dans la régénérescence du cartilage à huit semaines et les signes précurseurs d’une telle guérison sont connus. En effet, des études antérieures ont démontré qu’après deux semaines, les implants chitosane-GP/sang solidifiés in situ promeuvent le recrutement d’ostéoclastes et l’intégration du tissu de réparation tandis qu’après trois semaines, les lésions traitées sont infiltrées de neutrophiles, l’os sous-chondral est fortement remodelé et le dépôt de collagène de type II et de glycosaminoglycans est retardé (voir Tableau 1.1). L’observation de tous ces phénomènes dans les lésions traitées avec des implants sous-chondraux pré-solidifiés est donc un signe encourageant qui démontre la réponse cellulaire et tissulaire à nos implants. De plus, les différences entre les lésions contrôles et les lésions traitées étaient très évidentes. Avec seulement 5 lapins, nous avons réussi à obtenir des différences statistiquement significatives, ce qui témoigne de l’impact marqué de nos implants, de la force de la réponse biologique et du succès de notre étude. Avec cette validation en main, nous pourrons mettre sur pied des études à plus long terme contenant plus d’animaux en sachant que nos implants ont un potentiel réel. L’impact de nos implants et du poids moléculaire de leur chitosane pourra alors donc être évalué.
L’évaluation de l’impact du poids moléculaire du chitosane sur les réponses cellulaires et tissulaires est un point important qui mérite d’être approfondi. Nous savons maintenant que le poids moléculaire du chitosane détermine sa résidence dans la lésion et éventuellement, les impacts spécifiques de cette caractéristique sur les réponses subséquentes pourront être dressés. Le poids moléculaire du chitosane pourrait donc devenir une cible de choix pour moduler la régénérescence du cartilage induite par le chitosane.
Une période d’inflammation est inévitable et bénéfique dans les techniques de régénérescence du cartilage par le chitosane. En effet, cette inflammation permet de recruter des neutrophiles, qui sécréteront alors divers chémoattractants qui vont engendrer la chimiotaxie des cellules impliquées dans la régénérescence du tissu, dont les ostéoclastes. Par contre, cette série d’évènements est conditionnelle à ce que le tissu de granulation présent durant la période inflammatoire soit progressivement changé pour un tissu cartilagineux ou osseux. Une inflammation prolongée risque de causer un rejet par encapsulation de l’implant dans une capsule
fibreuse (Anderson, Rodriguez, & Chang, 2008). En ce sens, il est donc possible que l’implant 150K ait une clairance trop faible, persiste dans la lésion trop longtemps et induise une réaction inflammatoire trop soutenue. Des études à plus long terme devront donc être élaborées afin de vérifier cette hypothèse.
Le recrutement d’ostéoclastes et remodelage osseux ont été liés à une augmentation de la vascularisation, un évènement anabolique précédemment observé dans la régénérescence du cartilage par le chitosane (Chevrier, et al., 2007, 2011). Dans l’apoptose d’ostéocytes, un évènement précurseur du recrutement d’ostéoclastes et de la résorption osseuse (Aguirre et al.,
2006), il a été démontré que l’expression des facteurs insulin-like growth-factor-1 (IGF-1),
vascular endothelial growth factor (VEGF) et interleukine-6 (IL-6) est haussée (Cheung, Liu, Tonelli-Zasarsky, Simmons, & You, 2011). IGF-1, un facteur angiogénique notamment présent dans les muscles squelettiques (Rabinovsky & Draghia-Akli, 2004) est un marqueur des macrophages alternativement activés (Kodelja et al., 1997; Martinez, Gordon, Locati, & Mantovani, 2006) qui sont recrutés dans les lésions traitées par le chitosane (Hoemann, et al., 2010). IGF-1 induit aussi la migration de précurseurs d’ostéoclastes (Formigli et al., 1997) ainsi que la formation et l’activation des ostéoclastes (Mochizuki et al., 1992). VEGF, un facteur connu pour promouvoir l’angiogénèse et la vasculogénèse, promeut le recrutement d’ostéoclastes et l’ostéoclastogénèse (Kohno et al., 2003; Niida et al., 1999). IL-6, impliqué dans la vasculogénèse cérébrale (Fee et al., 2000), est aussi impliqué dans le recrutement de monocytes (Romano et al., 1997) et promeut l’ostéoclastogénèse (Devlin, Reddy, Savino, Ciliberto, & Roodman, 1998; Kurihara, Bertolini, Suda, Akiyama, & Roodman, 1990). Bien qu’il a été démontré qu’IL-6 n’était pas libéré in vitro par des caillots de chitosane-GP/sang (Hoemann, et al., 2010) ou des macrophages murins dérivés de la moelle osseuse (Guzman-Morales, et al., 2011), il existe néanmoins un lien étroit entre le recrutement d’ostéoclastes, le remodelage osseux et l’angiogénèse qui devra être investigué dans le futur.
Le facteur tissulaire (TF) a auparavant été directement associé à des évènements anaboliques, notamment en stimulant la production de vascular endothelial growth factor (VEGF), un facteur angiogénique, par les fibroblastes (Ollivier, Bentolila, Chabbat, Hakim, & de Prost, 1998). Comme le TF a été utilisé dans tous les implants afin de stimuler la coagulation, il est possible qu’une partie des évènements observés dans les lésions traitées ne soit pas totalement attribuables au chitosane de l’implant. Par contre, la moitié des contrôles (2/4) ont aussi été traités avec du
TF, ce qui suppose que ces lésions auraient aussi bénéficié des propriétés anaboliques du TF. En raison des différences très importantes entre les tissus de réparation des lésions traités et des contrôles, nous pouvons affirmer avec confiance que l’implant chitosane-GP/sang engendre bel et bien une réponse biologique importante.
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
Ce projet a permis de remplir tous les objectifs spécifiques que nous nous étions initialement fixés, en plus de paver la voie à l’élucidation de son objectif général. En effet, nous avons effectivement créé in vitro trois implants chitosane/sang pré-solidifiés de poids moléculaires distincts dans lesquels les particules de chitosane étaient distribuées de manière homogène. Ces implants ont montré une résistance et une souplesse suffisantes pour être insérés dans les trochlées de 5 lapins, dans lesquelles ils ont été résidents pendant les trois semaines de traitement malgré leur dégradation. Les implants ont engendré le recrutement de neutrophiles et d’ostéoclastes, le remodelage de l’os sous-chondral, l’intégration accrue du tissu de réparation et le délai du dépôt de glycosaminoglycanes, de collagène de type I et de collagène de type II. Les implants de chitosane 150K ont été les plus persistants dans les lésions et ont causé le recrutement de neutrophiles le plus fort et le plus soutenu ainsi que le remodelage de l’os sous- chondral le plus important. Pour ce qui est de notre objectif principal, nous avons réussi à comparer certains des évènements associés à la régénérescence du cartilage causés par nos implants avec ceux observés dans d’autres études évaluant l’impact d’implants basés sur le chitosane. Comme nous l’avions prédit, la réponse après trois semaines était non seulement similaire, mais encore plus forte que celle observée antérieurement.
Afin d’optimiser nos méthodes de régénérescence du cartilage par le chitosane, il est essentiel d’en comprendre davantage sur son mécanisme d’action. En effet, il a été démontré que le chitosane induit la polarisation des macrophages vers un phénotype alternatif associé à la croissance tissulaire et à l’angiogénèse (Hoemann, et al., 2010). Par contre, les médiateurs impliqués dans cette différentiation demeurent inconnus. Nous savons entre autres que le chitosane partiellement désacétylé est chémotactique pour les neutrophiles selon un mécanisme qui dépend partiellement du leukotriene B4 (LTB4), un chémoattractant sécrété par les
neutrophiles (Simard, et al., 2009). Nous savons aussi que les mastocytes sont recrutés par le (LTB4) et qu’ils expriment l’interleukin-4, cytokine responsable de l’activation alternative des
macrophages. Notre première recommandation est donc de vérifier ce modèle théorique dans une étude ultérieure par la détection des mastocytes dans des tissus dans lesquels du chitosane a précédemment été implanté.
L’effet du taux de désacétylation sur les propriétés chimiotactiques du chitosan est connu (Simard, et al., 2009), mais l’impact de l’arrangement des résidus N-acétylglucosamine ne l’est pas. Lorsque le chitosane est partiellement désacétylé, les résidus N-acétylglucosamine qui restent sont arrangés en blocs. Si on désacétyle complètement le chitosan et qu’on le réacétyle, les résidus N-acétylglucosamine s’inséreront sur la chaîne polymérique de manière aléatoire. Une autre proposition d’étude serait donc d’étudier les répercussions de la distribution des résidus N- acétylglucosamine sur différents aspects liés à la régénérescence tissulaire, comme le recrutement de neutrophiles et la libération de chémoattractants comme le LTB4.
Dans le but d’accélérer la solidification des implants chitosane/sang, des études in vitro pourraient être effectuées afin de déterminer les mécanismes moléculaires qui expliquent le ralentissement de la coagulation induit par le chitosane. En mélangeant des solutions de chitosane à du sang complet ou du plasma recalcifié, il pourrait être utile d’extraire les différentes phases du caillot et d’investiguer la liaison potentielle du chitosane à divers facteurs de coagulation. Nous savons par exemple que le chitosane se lie avec plusieurs facteurs du système du complément (Marchand et al., 2010) et il est possible que le chitosane se lie à des facteurs de coagulation et empêche ainsi leur activation, ce qui freine le déroulement de la cascade de coagulation. L’identification de telles liaisons pourrait permettre d’éclaircir les éléments à cibler pour l’accélération de la coagulation des implants chitosane/sang.
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