Partie II : Etude de l’effet du TGF- β 1 sur les CSMs et les chondrocytes II.6. Discussion Les TGFβs jouent un rôle important dans la différenciation des CSMs en chondrocytes, rôle qui dépend du stade de différenciation des cellules. Les études montrent qu’ils activent les premiers stades de la différenciation chondroblastique, mais inhibent la maturation des chondrocytes. In vivo, au sein du cartilage, les TGFβs interviennent de façon importante dans l’homéostasie du tissu au niveau de l’anabolisme. De plus, il a été montré que le TGF-β1 accélère la migration et la différenciation des chondrocytes ensemencés dans des biomatériaux [Khoshfetrat AB et al, 2008]. Nous avons, dans cette deuxième partie du travail, étudié le comportement des cellules en présence du TGFβ. Notre étude a d’abord porté sur l’influence du facteur de croissance sur la viabilité et le métabolisme cellulaire. Ceci nous a permis de contrôler nos conditions de travail. Puis, nous avons étudié l’effet du facteur de croissance sur la phosphorylation de la protéine Smad3 et sur l’expression du gène codant pour la protéine Sox9, facteur de transcription majeur de la chondrogenèse. L’addition du facteur de croissance dans le milieu de culture, quelque soit la concentration, n’as pas d’effet sur la viabilité cellulaire. En effet, un pourcentage de cellules vivantes qui avoisine 100% a été constaté. Cependant, une diminution du métabolisme des cellules en présence du TGF-β1 a été observée pour toutes les concentrations utilisées, avec un effet maximum à 10 ng/mL. Par ailleurs, le TGF-β1 intervient sur la prolifération des cellules. Après un jour de culture, le TGF-β1 induit une augmentation de la prolifération. Par contre, au bout de 3 jours, quand les CSMs commencent à se différencier, leur prolifération est diminuée. On peut faire l’hypothèse que la prolifération et la différenciation des CSMs sont antagonistes. Ces résultats sont en accord avec ceux de Plasilova M et al. qui ont trouvé que les CSMs ne peuvent pas proliférer et se différencier simultanément [Plasilova Met al, 2009]. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet du TGF-β1 sur la phosphorylation des protéines Smad3. Il a été montré que cette protéine est phosphorylée dans les premières étapes de la chondrogenèse, puis elle active Sox9, un facteur de transcription nécessaire à cette différentiation. De plus, la protéine Smad3 a un rôle déterminant pendant l’inhibition de la différenciation hypertrophique des chondrocytes. En absence de Smad3, les chondrocytes se différencient anormalement et ceci conduit au développement de l’ostéo-arthrite [Yang X et al, 2001]. Même si le mécanisme de l’effet des TGFβs sur la chondrogenèse des CSMs reste obscur, il est de plus en plus évident que l’effet du TGF-β1 sur les différents stades de différenciation a un effet dépendant du temps. Plusieurs études ont montré que le TGF-β1 peut activer rapidement la voie de signalisation des Smads dans différentes types cellulaires [Seay U et al, 2005; Palmer G et al, 2000; Watanabe H et al, 2001;]. En effet, la phosphorylation des R-Smads est augmentée après 30 minutes de traitement des cellules avec du TGF-β1, atteint son niveau maximum à 1 heure, puis diminue après 3 heures. Par ailleurs, Worster AA et al ont trouvé que l’effet de TGF-β1 sur les CSMs est dépendant de la concentration. Ils ont comparé trois concentrations de TGF-β1 (1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL) sur la différenciation des CSMs en chondrocytes pendant 4 jours. La concentration de 5 ng/mL optimise la différenciation des CSMs et l’expression des gènes de Collagène I et Collagène II [Worster AA et al, 2000]. Khoshfetrat AB et al. ont également trouvé que la concentration de 5 ng/mL favorise la migration et la différenciation des chondrocytes encapsulés dans des hydrogels [Khoshfetrat AB et al, 2008]. Dans notre étude, nous avons confirmé que le TGF-β1 a une action dépendante de la concentration sur les deux types cellulaires utilisés, CSMs et chondrocytes. Dans notre modèle de culture, la phosphorylation des protéines Smad3 augmente avec une concentration de 1ng/mL, atteint son niveau maximal à 5 ng/mL puis diminue à 10 ng/mL, tout en restant inférieur au témoin sans TGF-β1. Cette phosphorylation des protéines Smad3 est accompagnée d’une translocation nucléaire observée par microscopie de fluorescence. Dans un troisième temps, l’effet du TGF-β1 sur l’expression des gènes de Sox9, de RunX2 et de PPARγ a été analysé. Nous avons réalisé ces expériences avec une concentration de TGF-β1 de 5 ng/mL. Selon les résultats de RT-PCR, l’expression de Sox9 dans les CSMs est augmentée en présence de TGF-β1, de façon plus importante après 1 heure d’incubation qu’après 30 minutes. De plus, l’augmentation de l’expression de Sox9 induite par le TGF-β1 coïncide avec la phosphorylation de Smad3 dans le temps. Selon la littérature, les deux facteurs de transcription, aussi bien Sox9 que Smad3 interviennent dans les premiers stades de la chondrogenèse [Yang X et al, 2001 ; Furumatsu T et al, 2005]. On peut donc émettre une hypothèse selon laquelle Smad3p qui se translocalise dans le noyau activerait l’expression de Sox9. Ensuite, Smad3p et Sox9 forment un complexe de transcription qui s’associe à la région d’enhancer du gène de Collagène II et active l’expression de son ARNm. En conclusion, on peut retenir les points suivants de cette partie: 1. Le TGF-β1 augmente la phosphorylation de la protéine Smad3 dans les CSMs et les chondrocytes après 1h de stimulation. 2. L’effet du TGF-β1 sur la phosphorylation de Smad3 est dépendant de la concentration, avec un effet maximum à 5ng/mL. Dans le document Mécanotransduction et cellules souches mésenchymateuses humaines : Etude de l'effet d'une contrainte d'étirement équibiaxial sur la voie de TGF-ß (Page 154-157)