1 Discussion complémentaire au chapitre II

L’étude présentée au chapitre II s’est intéressée à l’identification des meilleurs gènes de normalisation pour la quantification par qPCR des miARNs au cours du développement pulmonaire chez la souris. Cinq gènes de normalisation ont été testés avec 3 méthodes de calculs différentes. Les gènes de normalisation ayant fait l’objet de l’étude sont des petits ARNs nucléolaires (« small nucleolar RNA », snoRNA) appartenant à la grande famille des ARN non codants. La stabilité de ces gènes de normalisation a été étudiée selon le sexe et différents temps gestationnels, allant du stade pseudoglandulaire au stade alvéolaire ainsi que chez l’adulte. Les trois méthodes d’analyse ont permis de choisir les meilleurs gènes présentant la plus faible variation pour chaque stade du développement ainsi que ceux les plus stables à travers tous les stades.

Suite à la découverte des miARNs au début des années 2000, l’étude de leur expression dans différents modèles expérimentaux a fait l’objet d’un très grand nombre de publications. L’intérêt porté à ces nouvelles molécules régulatrices a aussi permis le développement de plusieurs approches techniques permettant de mieux les étudier. La quantification des miARNs par qPCR était l’un des premiers défis important à relever à cause de leur petite taille qui ne dépasse pas 24 nt. Plusieurs approches ont été développées, cependant les techniques utilisées varient et peuvent introduire des biais dans la quantification des miARNs. Les différentes approches sont basées sur le même principe qui est de prolonger la taille des miARNs lors de la transcription inverse, étape qui sera suivie d’une quantification par qPCR (Chen et al., 2005; Shi and Chiang, 2005). Pour ce projet nous avons utilisé la méthode de Chen et al (Chen et al., 2005; Varkonyi-Gasic et al., 2007). L’approche de Chen et al est basée sur l’utilisation d’une amorce spécifique pour chaque miARN lors de la transcription inverse (Chen et al., 2005). Cette amorce est caractérisée par une forme en hairpin et une séquence universelle à laquelle sont ajoutés quelques nucléotides spécifiques pour le miARN

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d’intérêt. Quant à l’approche de Shi et al, elle est basée sur une polyadénylation de l’ARN et une transcription inverse utilisant un oligonucléotide Poly(dT) (Shi and Chiang, 2005). Avec la première méthode on obtient un ADN complémentaire spécifique pour chaque miARN d’intérêt, contrairement à la deuxième méthode où nous obtenons un ADNc non spécifique. Par la suite, le principe de la PCR est presque similaire entre les deux approches. En effet, dans la première méthode ils utilisent une amorce sens spécifique au miARN et une amorce antisens spécifique à la séquence universelle de l’amorce utilisée lors de la transcription inverse. Dans la deuxième méthode, ils utilisent également une amorce sens spécifique au miARN et une amorce antisens complémentaire à l’oligonucléotide Poly(T). Ces deux approches techniques sont utilisées et commercialisées par plusieurs compagnies. Cette méthode est la plus spécifique et la mieux adaptée à notre étude. En effet, une étude qui a comparé les deux méthodologies a montré que l’utilisation d’une amorce spécifique lors de la transcription inverse augmente la spécificité de la PCR. Cependant, en contrepartie, cette technique est moins adaptée à la quantification des miARNs très faiblement exprimés (Chugh and Dittmer, 2012). Également, une autre étude a comparé deux kits commerciaux qui se basent sur ces deux méthodes. Cette étude a montré que les deux kits présentaient la même efficacité. Cependant, le kit basé sur la transcription inverse non-spécifique présentait le plus de variabilité. Cependant, le résultat le plus étonnant est que le nombre de copies de miARN calculé à partir de la même courbe standard peut varier significativement entre les deux techniques (Redshaw et al., 2013). Ces études m’ont conduit à me questionner d’avantage sur la méthodologie qu’on devrait choisir pour quantifier les miARNs, mais également à être prudente quant aux comparaisons des résultats provenant de deux méthodologies différentes.

Nos analyses de stabilité des gènes de référence ont été effectuées avec trois logiciels classiques et couramment utilisés, qui sont geNorm, NormFinder et Bestkeeper. Ces trois logiciels utilisent trois méthodes de calculs différentes. Nos résultats ont montré que les trois méthodes ne donnent pas toujours le même

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résultat. Des gènes peuvent être proposés comme étant plus stables avec une méthode et moins stables avec une autre. BestKeeper présente le plus de divergence dans les gènes stables proposés par rapport aux propositions obtenues avec les deux autres logiciels. Ceci n’est pas étonnant car BestKeeper se base sur les valeurs de Cq (cycle de quantification) contrairement aux deux autres méthodes qui utilisent les valeurs rapportées sur une courbe standard (Pfaffl et al., 2004). NormFinder et geNorm déterminent la variabilité de chaque gène en tenant compte de la variabilité des autres gènes de références dans le but de proposer la meilleure combinaison de gènes stables parmi l’ensemble des gènes analysés (Andersen et al., 2004; Vandesompele et al., 2002). Nos résultats montrent que ces deux logiciels donnent des résultats presque similaires. Une étude récente a proposé de corriger les valeurs d’expression avec l’efficacité PCR de chaque gène avant de procéder à l’analyse de la stabilité avec les différentes méthodes (De Spiegelaere et al., 2015). En comparant des valeurs d’expression non-corrigées et corrigées avec l’efficacité PCR, ils ont montré que le classement des gènes selon leur stabilité a changé pour au-delà de 50% des gènes analysés avec geNorm et NormFinder (De Spiegelaere et al., 2015). Nos travaux ont été publiés un an avant la sortie de cette étude. Ce résultat est intéressant et devrait être pris en considération dans nos conditions expérimentales afin de déterminer si la correction avec l’efficacité PCR aura un impact sur la quantification des miARNs.

Sachant que l’expression de plusieurs gènes varie au cours du développement et que plusieurs présentent un dimorphisme sexuel (Simard et al., 2006), nous ne pouvons utiliser des gènes de référence sans nous assurer de leur stabilité dans nos propres conditions expérimentales. Nos résultats ont montré l’importance d’analyser la stabilité des gènes de normalisation avant de procéder à une quantification relative des miARNs, car la stabilité des gènes peut varier selon l’âge gestationnel et également selon le sexe. Nos résultats ont montré également que la quantification relative d’un miARN avec des gènes de normalisation qui ne sont pas stables peut introduire une fausse variation qui biaiserait l’interprétation des résultats.

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