structurale du domaine extracellulaire de DC-SIGN
CHAPITRE 3 : Caractérisation biochimique et
A- Dimère B Trimère
C- Tétramère
(dimère-dimère)
D- Tétramère
GCN4
Neck du
MBP-A
GCN4
mutée
Tetrabrachion
Influence de la position e et g dans l’orientation du coiled-coil: les interactions coiled- coil réalisées entre les monomères permettent d’orienter leur oligomérisation. En effet, l’homo- ou l’hétéro-oligomérisation peut être parallèle ou anti-parallèle. Dans le cas d’un peptide avec une séquence qui comporte deux heptades, la première heptade est désignée par les lettres abcdefg et la deuxième heptade par a’b’c’d’e’f’g’. Les interactions parallèles nécessitent la présence d’un pont salin entre les résidus e et g’ ou g et e’. Par contre, les interactions anti-parallèles impliquent la présence de ponts salins entre les résidus en position e et e’ ou g et g’ (Monera et al. 1994 et 1993).
Modèles d’interactions coiled-coil: les interactions coiled-coil sont responsables de l’organisation oligomérique de nombreuses protéines en dimère, trimère, tétramère (figure.5) et même en un ordre oligomérique supérieur. Dans le cas d’un dimère ou d’un trimères, les interactions réalisées entre les hélices α de chaque monomère de type coiled-coil s’organisent autour d’un cœur hydrophobe. Quant au modèle tétramèrique, il existe deux types différents d’organisation :
- Le modèle d’interaction tétramère proprement dit avec 4 monomères où leurs hélices alpha s’enroulent autour d’un cœur hydrophobe.
- Le modèle d’interaction dimère de dimère : deux monomères interagissent entre eux par des interactions hydrophobes et avec un autre dimère par des ponts salins.
En prenant en considération le niveau d’oligomérisation de DC-SIGN, c’est les 2 modèles tétramèriques qui nous intéressent dans la suite de l’étude.
4.2.2. La région Neck de DC-SIGN:
4.2.2.1. Information sur l’organisation de la région Neck de DC-SIGN:
La région Neck de DC-SIGN est composée d’un motif de 23 acides aminés répétés 7,5 fois (figure.6). Ces motifs démontrent un profil de résidus hydrophobes espacés d’un intervalle bien défini et évoquent une interaction possible de type coiled-coil (McLachlan et al. 1975, Stetefeld et al. 2000).
Figure.6: Présentation des 7,5 motifs répétés de la région Neck de DC-SIGN (région 66- 252). On note par abcdefg les acides aminés d’un motif répété en heptade responsable de l’interaction coiled-coil.
A cela s’ajoute le travail de Mitchell qui démontre, par soustraction du spectre de dichroïsme circulaire (CD) d’ECD par celui du CRD, que le spectre de la région Neck a le profil typique d’une organisation en hélice α (Mitchell et al. 2001). De plus, la résolution de la structure du domaine CRD avec une partie du 8éme motif répété de DC-SIGN R, un homologue de DC-SIGN, démontre l’organisation en hélices alpha de ce motif (figure.7).
Figure.7: La structure du CRD avec un motif répété de la région Neck de DC-SIGN R. (PDB:1XPH, Snyder et al. 2005).
Il a été démontré que la longueur de la zone d’interaction coiled-coil peut influencer le niveau d’oligomérisation (Fairman et al. 1995). Des constructions protéiques de DC-SIGN et de DC-SIGN R ont été réalisées avec un nombre variable de motifs répétés au sein de la séquence Neck (Feinberg et al. 2005). Il s’est avéré que le nombre de motifs répétés de 23
CRD
Un motif répété de la région Neck
ab cde f g ab cd ef g ab cd
IYQN LTQLKAA VGEL SEKSK repeat 1
LQEIYQE LTQLKAA VGEL PEKSK repeat 2
LQEIYQE LTRLKAA VGEL PEKSK repeat 3
LQEIYQE LTWLKAA VGEL PEKSK repeat 4
MQEIYQE LTRLKAA VGEL PEKSK repeat 5
QQEIYQE LTRLKAA VGEL PEKSK repeat 6
QQEIYQE LTRLKAA VGEL PEKSK repeat 7
acides aminés est crucial dans le maintien de l’état oligomérique, et cela est d’aussi vrai pour DC-SIGN que pour DC-SIGN R. En effet, la suppression de 2 motifs répétés en N-terminal du domaine extracellulaire de DC-SIGN conduit à un équilibre dimère-tétramère. La suppression de 5,5 motifs conduit à un équilibre dimère/monomère et la perte de 7 motifs forme un monomère (figure.8). Ces résultats permettent encore une fois de plus de suggérer l’hypothèse d’une interaction coiled-coil au sein de la région Neck.
Figure.8: Les différentes constructions tronquées de DC-SIGN R et EC réalisés par Feinberg et al. 2005.
4.2.2.2. Construction protéique de la région Neck de DC-SIGN : importante, dure... et ignorée.
Plusieurs équipes qui travaillent sur DC-SIGN ont publié des résultats attestant que la reconnaissance du sucre par le domaine de reconnaissance CRD est altérée avec la chute du pH (Snyder et al. 2005, Gramberg et al. 2008). Une de ces équipes atteste, avec une expérience de BIAcore sommaire, de la stabilité du tétramère de DC-SIGN à la variation du pH (Snyder et al. 2005). Ainsi, la croyance générale est que la perte de reconnaissance est dû uniquement à une désensibilisation de la part du CRD vis-à-vis du sucre. Cette absence d’investigation sur la région Neck de DC-SIGN est due principalement à deux raisons différentes :
- Comme la région Neck dispose de 7.5 motifs répétés au sein de sa séquence, il est possible donc de croire que la présence du CRD est indispensable pour le bon alignement de ces motifs répétés lors de l'oligomérisation du domaine EC.
- La difficulté d'obtenir des fragments de la région Neck seule, puisque la répétition des séquences se retrouve au niveau nucléique et empêche la conception d’amorces spécifiques d’un motif par rapport à un autre.
Il est à noter que, pour le moment, il n’existe pas un travail publié centré sur une caractérisation biochimique de la région Neck pour cette grande famille de lectines de type C.
Détails sur les contributions au travail :
La production et la purification des différentes constructions ont été réalisées par nos soins. J’ai également réalisé des études d’état oligomerique en fonction des différents paramètres physico-chimiques (pH et force ionique), conduit des expériences d’ultracentrifugation analytique et participé à des collectes de données SAXS. L’analyse des données d’ultracentrifugation analytique a été menée avec l’aide de David Stroebel et les données SAXS analysés par Dominique Durand.
Michel Thepaut, de notre équipe, a réalisé le modèle structural en accord avec ces données SAXS.
Le travail réalisé met en avant les observations et les conclusions suivantes :
- Lors de la purification de DC-SIGN Neck sur gel filtration, deux pics ont été observés sur le chromatogramme correspondant à deux états oligomérique de la protéine (monomère et tétramère).
- Il existe un équilibre entre la forme monomérique et tétramérique de la protéine DC- SIGN Neck.
- L’état tétramérique de DC-SIGN Neck est maintenu grâce à des interactions type coiled-coil autour d’un cœur hydrophobe, éliminant ainsi le modèle d’interaction dimère de dimère.
- L’intégrité structurale de DC-SIGN Neck et EC est affectée par la variation du pH et influence ainsi l’état oligomérique de la protéine. Ceci aurait donc un effet sur le mécanisme de reconnaissance multivalent d’une structure osidique.
- Au-delà du Neck, le pH affecte également la structure du CRD lui-même.
- Une enveloppe SAXS du domaine extracellulaire de DC-SIGN a été obtenue soulignant le caractère très étendu de ce récepteur avec une dimension de l’ordre de 320Å.
- Un modèle structural de DC-SIGN tétramérique en bonne adéquation avec les données SAXS a pu être proposé.
- Ce travail suggère que les têtes CRDs doivent être en position relevée afin de pouvoir être bien placées dans l’enveloppe obtenue par SAXS.