Dichro¨ısme circulaire

Les mesures ont ´et´e effectu´ees sur un appareil JASCO J-815 avec des cellules en quartz de trajet optique 1 mm.

B.3.1 Principe

On dit qu’un mat´eriau pr´esente un dichro¨ısme circulaire s’il absorbe diff´eremment la lumi`ere selon que sa polarisation est circulaire droite ou circulaire gauche. C’est, par exemple, le cas des solutions de mol´ecules chirales.

La spectroscopie de dichro¨ısme circulaire peut ˆetre mesur´ee de deux mani`eres :

1. soit on mesure la diff´erence d’absorption de la lumi`ere polaris´ee circulairement gauche et de la lumi`ere polaris´ee circulairement droite en fonction de la longueur d’onde comme pr´esent´e figure B.4.

Le dichro¨ısme circulaire DC peut alors ˆetre exprim´e en L.mol−1_.cm−1 _{comme suit :} DC = ∆ε = εgauche−εdroite, (B.13)

(B.14) avec ε le coefficient d’extinction molaire en L.mol−1_.cm−1_.

2. soit on mesure l’ellipticit´e induite sur une onde polaris´ee rectilignement. En effet, une onde incidente polaris´ee rectilignement peut se d´ecomposer en deux parties, l’une circulaire droite et l’autre circulaire gauche. En traversant un ´echantillon optiquement actif, chaque polarisation va rencontrer un indice de r´efraction et un coefficient d’absorption qui lui sont propres. Ainsi, en sortie de l’´echantillon, les deux ondes polaris´ees se recomposent avec des amplitudes et des retards diff´erents. L’onde r´esultante est alors une onde elliptique. Dans le cas des peptides, le dichro¨ısme circulaire DC peut alors ˆetre exprim´e comme suit, en deg.cm2.dmol−1_.residu−1 _:

DC = [ψ] = 0.1 ψ M R

l C , (B.15)

avec ψ l’ellipticit´e mesur´e par l’appareil en millidegr´e, M R la masse molaire moyenne d’un r´esidu en g.mol−1 _{(M R =masse molaire de la prot´eine/nombre de r´esidus), l le trajet}

optique en cm et C la concentration en prot´eine en g.L−1_.

Ces deux expressions sont directement reli´ees par

[ψ] = 3298∆ε. (B.16)

B.3.2 Etude de la structure des prot´eines

Les prot´eines sont des mol´ecules optiquement actives, elles pr´esentent donc un dichro¨ısme circulaire. Ce dernier d´epend de la structure adopt´ee par la prot´eine. On peut d´efinir deux r´egions spectrales d’int´erˆet :

– l’UV lointain, entre 170 et 250 nm, domin´ee par l’absorbance des liaisons peptidiques, – l’UV proche, entre 250 et 300 nm, domin´ee par l’absorbance des acides amin´es aromatiques.

R´egion spectrale Longueur d’onde

Chromophores responsable de l’absorption UV lointain 190 - 230 nm liaison peptidique

UV proche

250 - 270 nm phenylalanine 270 - 290 nm tyrosine 280 - 300 nm tryptophane 250 - 350 nm pont disulfure

Table_{B.3 – R´ecapitulatif des r´egions spectrales d’int´erˆet en dichro¨ısme circulaire des prot´eines.} Le signal de dichro¨ısme circulaire en UV lointain renseigne sur la structure secondaire de la prot´eine. Il est assez sensible `a la pr´esence de structures ordonn´ees et est ainsi caract´eristique de la conformation de la prot´eine. Il est donc souvent utilis´e pour l’´etude du repliement et en particulier pour suivre l’apparition des structures secondaires.

Les principaux types de structure secondaire (h´elice α, feuillet β, structure non ordonn´ee ...) donnent un signal caract´eristique pr´esent´e figure B.5.

Figure _{B.5 – Spectres de dichro¨ısme circulaire de la poly(Lys) en conformation (α) h´elice α,} (β) feuillet β, (n) structure non ordonn´ee d’apr`es [Greenfield et Fasman 1969].

Il est possible de d´eterminer la proportion de chaque type de structure secondaire dans une prot´eine en d´econvoluant son spectre de dichro¨ısme circulaire. Dans ce travail, nous avons utilis´e le programme d’analyse DichroWeb [Whitmore].

B.3.3 Utilisation du programme DichroWeb

La d´econvolution des spectres de dichro¨ısme circulaire de la CAB (cf. page93) a ´et´e effectu´ee avec le logiciel DichroWeb pour le programme CONTINLL et avec la base de donn´ees de r´ef´erence SP175. Ce choix d´epend notamment des longueurs d’onde exp´erimentales disponibles (pour nous la longueur d’onde minimale = 190 nm).

Bibliographie

[Greenfield et Fasman 1969] N.J. Greenfield and G.D. Fasman. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry, vol. 8, no. 10, pages 4108–4116, 1969.

[Potier et al. 2003] I. Le Potier, M. Taverna and P. Morin. Electrophor`ese capillaire. In Techniques d’analyse. Techniques de l’Ing´enieur edition, December 2003.

[Whitmore ] Lee Whitmore. DichroWeb. http://dichroweb.cryst.bbk.ac. uk/html/home.shtml.

Etude de l’association

polym`ere/tensio-actif

Sommaire

C.1 Influence des param`etres k et < L > sur la valeur de lC dans le cadre

de l’ajustement des donn´ees d’´electrophor`ese capillaire . . . 147

C.1

Influence des param`etres k et < L > sur la valeur de l

C

dans le cadre de l’ajustement des donn´ees d’´electrophor`ese

capillaire

On ajuste le param`etre lC de l’´equation3.8 pour diff´erentes valeurs de k et < L > suivant les valeurs exp´erimentales issues des mesures d’´electrophor`ese capillaire.

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 TX 100 lié /polymer (g/g) 10 8 6 4 2 0

Taux de modification du polymère (%)

Effet de k

Courbe ( ) ( ) ( ) k 1.5 1.4 1.3 < L > 450 450 450 lC 2.9 3.7 4.8

Figure _{C.1 – Effet de la variation de k sur la valeur de lC. Repr´esentation de l’´equation 3.8} avec les param`etres donn´es dans le tableau.

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 TX 100 lié /polymer (g/g) 10 8 6 4 2 0

Taux de modification du polymère (%)

Effet de <L>

Courbe ( ) ( ) k 1.4 1.4 < L > 450 600 lC 3.7 2.8

Figure _{C.2 – Effet de la variation de < L > sur la valeur de lC. Repr´esentation de l’´equation}

3.8avec les param`etres donn´es dans le tableau.

La variation des grandeurs k et < L > influe peu sur la d´etermination de lC qui reste dans l’intervalle 5 ± 2.

Etude du cytochrome C

Sommaire

D.1 Influence des d´erives dans les zones de pr´e et post-d´epliement sur les valeurs de ∆GH

2O . . . 149

D.2 Renormalisation de la fluorescence du cytochrome C en pr´esence

Dans le document Photo-renaturation de protéines par des macromolécules chaperonnes (Page 142-147)