Diagnostic

7.1. Différentiel

Le diagnostic différentiel de la RHD dépend de la forme clinique rencontrée (cf. 2. Symptômes

et évolution clinique). Il est présenté ci-dessous sous forme de tableau (Tableau 5). Concernant l’EBHS,

la maladie peut être confondue avec la toxoplasmose (Moinet, 2011).

Tableau 5. Diagnostic différentiel de la RHD (d’après Mitro and Krauss, 1993; Harkness et al., 2010) . Formes et signes cliniques Diagnostic différentiel

Forme suraiguë

Mort subite chez des lapins adultes sans signe

précurseur ● Stress aigu ● Pneumopathie aiguë ou chronique (Pasteurellose en particulier) ● Coup de chaleur ● Entérotoxémie (E. Coli,

Clostridium perfringens type E) ● Infections coliformes

● Cardiopathie ● Déshydratation ● Electrocution ● Intoxication

● Toxémie de gestation, cétose ● Rétention placentaire, toxémie à Clostridium spp.

● Myxomatose atypique ● Autres causes de septicémie avec CIVD secondaire

Forme aiguë / subaiguë Abattement, anorexie, hyperthermie, signes d’atteinte respiratoire et neurologique, mort en 48h.

Mêmes causes que pour les formes suraiguës, mais causant une atteinte plus

modérée. Forme chronique

Ictère

Hémolyse intravasculaire Atteinte hépatique

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7.2. Sérologique

7.2.1. ELISA

Les animaux infectés par un lagovirus pathogène séroconvertissent en quatre à six jours post-infection. Les anticorps produits lors de cette séroconversion peuvent être détectés via la méthode immuno-enzymatique ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Plusieurs méthodes ELISA sont utilisées dans les laboratoires de diagnostic :

• _{L’ELISA de compétition (cELISA) : ce test utilise un broyat de foie de lapin infecté et clarifié}

comme antigène. Les anticorps sont ensuite détectés à l’aide d’anticorps monoclonaux. Il est très spécifique et détecte principalement les anticorps dirigés contre les déterminants antigéniques sur la surface externe du virus (Lavazza and Capucci, 2008).

• _{L’ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-isotypes (isoELISA ou IgELISA) : ce test}

permet de détecter la présence d'IgM, d'IgA et d'IgG anti-RHDV (Cooke et al., 2000). Cette technique est plus sensible que le cELISA

• L’ELISA en phase solide : dans cet ELISA, les antigènes doivent être purifiés. Une fois purifiés,

ils sont adsorbés sur un support solide. L’adsorption va déformer le virus et permettre

l’exposition d’épitopes internes. Cet ELISA permet de détecter un spectre plus large

d’anticorps dirigés contre le virus pathogène, et augmente donc la sensibilité de la technique. Il peut ainsi être utilisé pour détecter des anticorps anti-EBHSV (Lavazza and Capucci, 2016).

7.2.2. Inhibition de l’hémagglutination

L’inhibition de l’hémagglutination (IHA) est un test à la fois sérologique et virologique, mais est

plus souvent utilisé dans la recherche d’anticorps dirigés contre le virus à étudier. Ce test consiste à mettre en contact des érythrocytes humains (groupe O en particulier), des anticorps antiviraux et des

antigènes viraux qui ont une propriété hémagglutinante. Dans le cadre d’un test sérologique, un sérum

de lapin est mis en contact avec de la protéine de capside.

Si le sérum est positif en anticorps antiviraux, il va inhiber la capacité hémagglutinante de la protéine de capside et aucune hémagglutination des érythrocytes humains ne sera observée. Ce test est plus souvent utilisé pour diagnostiquer le RHDV et le RHDV2 qui ont de fortes propriétés

hémagglutinantes (Lavazza and Capucci, 2016). La recherche d’anticorps anti-EBHSV peut également

être réalisée en IHA (Gavier-Widen and Morner, 1991) mais en raison du plus faible pouvoir

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7.3. Virologique

7.3.1. Hémagglutination

Le test d’hémagglutination ou HA test a été la première technique de diagnostic de laboratoire utilisée en routine pour le RHDV (Ohlinger et al., 1990). Ce test est moins sensible que les outils de

biologie moléculaire récents, mais a l’avantage d’être une technique simple et rapide à mettre en

place. Il peut être confirmé par un test IHA décrit précédemment (Lavazza and Capucci, 2016).

7.3.2. Western blot

Le western blot (WB), ou immunotransfert, basé sur la détection spécifique de protéines transférées sur une membrane de nitrocellulose, est une technique plus rarement utilisée en diagnostic. En effet, cette méthode est plus lourde à mettre en place, et sert généralement de

technique de confirmation lorsque le HA test et/ou l’ELISA donnent des résultats sérologiques douteux ou quand l’échantillon traité est trop riche en CLP (Lavazza and Capucci, 2016).

7.3.3. Immunohistochimie

L’immunohistochimie est une technique basée sur la détection des antigènes viraux au sein de

tissus ou de cellules. C’est une méthode lourde à mettre en place nécessitant des coupes de tissus

(foie, rate, rein, etc) qui doivent être préalablement fixées, lavées puis perméabilisées. Elles sont disposées sur des lames et sont ensuite incubées avec du sérum anti-RHDV ou des anticorps

monoclonaux spécifiques biotinylés. La révélation se fait grâce à l’incubation avec un complexe

avidine-biotine couplé à la péroxidase (Lavazza and Capucci, 2016).

7.3.4. Microscopie électronique

La microscopie électronique en coloration négative permet l’observation de particules virales.

Cette technique a tout d’abord été employée avec des suspensions de foie de lapins infectés par le

RHDV (Smid et al., 1989). L’observation de particules virales dans des matrices complexes n’est pas

simple, c’est pourquoi les suspensions d’organes ont été purifiées sur gradient de densité de

saccharose ou de chlorure de césium pour permettre d’identifier rapidement les particules virales

d’intérêt ainsi concentrées (Ohlinger et al., 1990). Le diagnostic a été amélioré avec l’utilisation de

l’immuno-microscopie électronique qui permet d’observer plus facilement les particules virales ainsi

que les CLP grâce à leur agrégation résultant de la réaction immunologique induite par leur incubation avec un sérum hyperimmun ou un AcM spécifique (Valicek et al., 1990; Capucci et al., 1991; Lavazza et al., 2015b). Cette méthode de diagnostic est longue à mettre en place et nécessite un matériel couteux et est plutôt réservée à des travaux de recherche sur les agents pathogènes ou à de la confirmation de résultat (Capucci et al., 1991).

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7.4. Moléculaire

7.4.1. Transcription inverse-PCR (RT-PCR)

Les outils de biologie moléculaire ont grandement facilité et amélioré le diagnostic d’agents

pathogènes. La première RT-PCR pour détecter du RHDV a été développée en 1995. Elle permettait

d’amplifier 500 paires de bases (pb) du gène codant la VP60 et a été décrite comme 104 fois plus

sensible que les méthodes ELISA (Guittré et al., 1995). Cette technique permet de détecter l’ARN viral

dans de nombreux tissus (Shien et al., 2000) et de pouvoir séquencer les produits amplifiés (Gould et al., 1997). Plus récemment, une multiplex RT-PCR a été mise en place pour détecter les souches recombinantes RDHV/RHDV2 (Hall et al., 2018).

7.4.2. RT-qPCR

La RT-PCR quantitative (RT-qPCR) est un test qui permet à la fois de détecter et de quantifier

l’ARN issud’un échantillon. Cette technique est plus spécifique que les RT-PCR. La sensibilité dépend

de la sonde et du jeu d’amorces sélectionné. Les marqueurs fluorescents les plus utilisées pour

détecter les lagovirus sont :

• Sonde Taqman : utilisée pour détecter le RHDV, la RT-qPCR permet de détecter jusqu’à 10

copies d’ARN par réaction (Gall et al., 2007). Cette méthode a aussi été développée pour détecter et quantifier le virus RHDV2 (Duarte et al., 2015b).

• SYBR Green I (SYBR) : utilisée pour détecter le RHDV, la RT-qPCR permet de détecter jusqu’à

6,09 copies de plasmide par réaction (Liu et al., 2015).

7.4.3. Immunocapture RT-PCR (IC-RT-PCR)

L’IC-RT-PCR est la seule technique qui permet de détecter spécifiquement l’ARN encapsidé. Les

particules virales sont tout d’abord capturées sur des anticorps spécifiques fixés dans une plaque ELISA

puis légèrement dénaturées. La RT est ensuite effectuée dans la plaque ELISA et les ADNs complémentaires (ADNc) générés sont ensuite analysés en PCR. Cette technique est moins sensible

qu’une RT-PCR classique mais 10 à 100 fois plus sensible qu’un ELISA sandwich (Le Gall-Recule et al.,

2001). Les méthodes disponibles pour le diagnostic de la RHD classées selon l’objectif recherché sont

rapportées dans le Tableau 6. Ce tableau est tiré de celui proposé dans le chapitre sur le RHD rédigé

par le laboratoire de référence de l’Office International des Epizooties (OIE) pour les caliciviroses des

lagomorphes (IZSLER, Brescia, Italie) du manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux

49 | P a g e Tableau 6.Méthodes et objectifs des outils de diagnostic disponibles pour le RHDV (d’après Lavazza and Capucci, 2016)