Dans le deuxième cycle secondaire

O processo de fracionamento da fração em acetato de etila do cultivo do fungo M. indicus em meio arroz-aveia foi desenvolvido de acordo com o esquema descrito nas Figuras 16 e 17. Previamente aos processos cromatográficos, a fração em acetato de etila (11878 mg) foi solubilizada em metanol e submetida a centrifugação à 3000 RPM por 3 minutos. Assim foi obtido um precipitado (insolúvel em MeOH) com massa de 2420 mg e uma fração solúvel em MeOH de 9458 mg (Figura 16). Tanto o precipitado quanto a fração solúvel foram submetidas a processos cromatográficos que envolveram: colunas de Sephadex LH-20, colunas de sílica gel e cromatografia preparativa em camada delgada, bem como técnicas de cristalização. O processo de isolamento foi monitorado através de cromatografia em camada delgada (CCD), observação em UV e revelação com anisaldeído.

3.12.3.1 Fração em acetato de etila - precipitado (MiEtOAc)

O processo de isolamento da fração insolúvel em metanol proveniente da fração em acetato de etila do cultivo de M. indicus em meio arroz-aveia foi desenvolvido por cromatografia clássica, seguida de passos de cristalização e técnica de precipitação, ilustrado na Figura 17. O primeiro passo foi o fracionamento em sílica gel [30 cm x 3,5 cm, 150 g de sílica gel, altura de 10 cm]. A coluna foi eluída utilizando um sistema gradiente de CH2Cl2:MeOH, iniciando com diclorometano 100% e elevando a concentração de metanol em

1% a cada 10 frações coletadas, sendo coletadas 100 frações de 100 mL cada. As frações coletadas foram submetidas à CCD, utilizando a fase móvel Hex:EtOAc (3:7) e as semelhantes foram agrupadas em três subfrações (Tabela 19).

Figura 17. Esquema de fracionamento da fração MiEtOAc precipitado.

Tabela 19. Cromatografia em coluna (CC) - MiEtOAc ppt (2420 mg).

Subfrações Frações reunidas Massa (mg)

1 1 – 30 1395

2 31 – 65 82

A subfração 1 (1400 mg) foi submetida a processo de cristalização, através da solubilização em 500 mL de CH2Cl2:MeOH (1:1) em balão de 1L, seguido de aquecimento e

posterior período de repouso (overnight) a 4˚C em geladeira. Posteriormente, os cristais foram recolhidos e pesados, resultando na obtenção de 1300 mg da substância denominada austidiol, obtida anteriormente a partir da fração diclorometânica.

A subfração 2 (85 mg) foi solubilizada em 200 mL de CH2Cl2:MeOH (1:1), aquecida e

mantida em repouso sobre a bancada e, em seguida, foi recolhido o precipitado (60 mg) que corresponde à substância denominada dímero de austidiol, pertencente a classe das azafilonas.

3.12.3.2 Fração em acetato de etila - solúvel em MeOH (M. indicus - EtOAc)

O fracionamento da porção solúvel em MeOH se deu de forma semelhante às etapas desenvolvidas para o fracionamento da fração diclorometânica, sendo utilizadas colunas Sephadex LH-20, colunas de sílica gel, cromatografia preparativa em camada delgada e lavagem com combinações de solventes orgânicos (Figura 18).

A fração em acetato de etila (9458 mg) foi submetida a gel filtração Sephadex LH-20, que permitiu a obtenção de 200 frações (10 mL), as quais foram submetidas à análise por CCD utilizando a fase móvel Hex:EtOAc (1:1). A análise cromatográfica das frações obtidas permitiu reuni-las em dez frações.

As frações reunidas foram submetidas à análise em CCD. Assim, foi observado que as frações 6 (592 mg), 7 (488 mg) e 8 (420 mg) provenientes da coluna Sephadex LH-20, apresentavam perfil promissor e foram selecionadas para continuidade dos processos de isolamento.

As três frações foram separadamente solubilizadas em MeOH e centrifugadas. A porção insolúvel que precipitou correspondeu à substância eugenitina (300 mg). Por sua vez a parte solúvel em MeOH de cada fração foi submetida aos processos cromatográficos esquematizados a seguir (Figura 18). As frações 6 (500 mg) e 7 (330 mg) foram analisadas por CCD e reunidas em uma mesma fração (Fr6-7). Esta fração foi submetida à coluna de sílica gel [25 cm x 2 cm, 50 g de sílica gel,altura de 15 cm]. A coluna foi eluída segundo o esquema apresentado na Tabela 20, fornecendo 18 frações de 100 mL cada. As frações coletadas foram submetidas à análise por CCD, utilizando a fase móvel CH2Cl2:MeOH (95:5).

De acordo com o perfil cromatográfico as frações semelhantes foram agrupadas, resultando em cinco subfrações, descritas na Tabela 21.

Tabela 20. Cromatografia em coluna (CC) - MiEtOAc6-7 (830 mg). Frações CH2Cl2:MeOH Volume (mL) Massa (mg)

1 100:0 100 45 2 100:0 100 57 3 100:0 100 55 4 99:1 100 51 5 99:1 100 79 6 98:2 100 65 7 98:2 100 55 8 97:3 100 23 9 97:3 100 22 10 96:4 100 28 11 96:4 100 26 12 95:5 100 42 13 95:5 100 35 14 95:5 100 41 15 90:10 100 25 16 90:10 100 33 17 90:10 100 41 18 0:100 100 66

Tabela 21. Agrupamento das frações obtidas por CC –MiEtOAc6-7 (461 mg).

Subfrações Frações reunidas Massa (mg)

1 1 – 3 157

2 4 – 7 250

3 8 – 9 45

4 10 – 14 170

5 15 – 18 165

A subfração 2 (250 mg) e a subfração 3 (45 mg) foram submetidas a lavagem com MeOH resfriado, gerando precipitados de intensa coloração amarela e fornecendo as substâncias austidiol (220 mg) e dímero de austidiol (40 mg) (Figura 18). Tais substâncias foram obtidas a partir da fração em acetato de etila insolúvel em MeOH e também a partir da fração diclorometânica do cultivo de M. indicus em meio sólido.

Por sua vez a fração 8 proveniente da coluna Sephadex foi submetida à fracionamento em sílica gel [25 cm x 2 cm, 30 g de sílica gel, altura de 15 cm]. A coluna foi eluída segundo o esquema apresentado na Tabela 22, fornecendo 12 frações de 100 mL cada. As frações coletadas foram analisadas por CCD, utilizando a fase móvel Hex:EtOAc (3:7) e agrupadas em cinco subfrações (Tabela 23).

Tabela 22. Cromatografia em coluna (CC) - MiEtOAc8 (300 mg).

Frações Hex:EtOAc Volume (mL) Massa (mg)

1 100:0 100 2 2 100:0 100 3 3 80:20 100 25 4 80:20 100 40 5 60:40 100 8 6 60:40 100 12 7 50:50 100 9 8 40:60 100 11 9 30:70 100 15 10 20:80 100 39 11 0:100 100 47 12 0:100 100 60

Tabela 23. Agrupamento das frações obtidas por CC – MiEtOAc8 (300 mg).

Subfrações Frações reunidas Massa (mg)

1 1 – 2 5

2 3 – 4 65

3 6 – 5 20

4 7 – 8 18

5 9 – 12 161

A subfração 2 (65 mg) e 3 (20 mg) apresentaram perfis cromatográficos interessantes para o prosseguimento do isolamento (atividade no UV). A subfração 2 foi submetida ao processo de lavagem com MeOH, obtendo-se 15 mg da substância eugenitina (insolúvel em MeOH), pertencente à classe dos cromenos. A parte solúvel em MeOH (40 mg) foi reunida com a subfração 3 (20 mg), resultando na subfração Fr8.2-3 (60 mg). Esta foi submetida à cromatografia preparativa em camada delgada, a fase móvel utilizada foi Hex:EtOAc (2:8), sendo as placas eluídas apenas uma vez. Assim, foi obtida a substância Fr8.2-3 (15 mg), que foi submetida a um último passo cromatográfico em pipeta Pasteur contendo sílica Florisil®, eluída com fase móvel isocrática de EtOAc:MeOH (99:1), com vistas a uma melhor purificação da amostra, gerando rendimento final de 5 mg da substância austidiol diidroisocumarina, a qual também foi obtida a partir da fração diclorometânica do cultivo em meio sólido.