1.Méthode de purification des enzymes de fusion
Le système de purification utilisé pour isoler l’enzyme d’intérêt (p300 ou PCAF) est un système dit « en batch ». La purification est effectuée par chromatographie d’affinité sur billes d’agarose couplées au glutathion (billes-glutathion), puis par chromatographie de chélation sur billes d’agarose couplées via un lien acide nitriloacétique à l’ion Ni2+ (billes-Ni-
NTA, Qiagen) (Figure 84). L’étiquette GST interagit avec son substrat, le glutathion, fixé aux billes d’agarose, et ainsi une première étape de purification est accomplie.
L’ion Ni2+ des billes Ni-NTA complexe l’étiquette polyhistidine et conduit à une
seconde étape de purification.
Dans le premier cas, la protéine doit être correctement repliée pour que la GST reconnaisse son ligand, alors que la seconde étape étant basée sur la reconnaissance d’une
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séquence d’histidine, ne nécessite pas que la protéine soit correctement repliée. Ces deux méthodes de purification ne seront pas systématiquement utilisées.
Lyse par sonication
sonde
cellules solubilisées dans le tampon de lyse
centrifugation débris cellulaires surnageant contenant
la protéine d'intérêt
Chromatographie d'affinité
billes-glutathion
Mise en contact la nuit sous agitation bille agarose GST GST GST glutathion autres protéines éliminées par lavage p300
GST GST GST
en présence d'un excès de ligand, la GST se décroche glutathion billes-Ni-NTA Mise en contact 1H sous agitation Chromatographie de chélation bille Ni-NTA GST GST GST autres protéines éliminées par lavage p300
GST GST GST
en présence d'un excès de ligand, la protéine se décroche
imidazole
Ni2+
6 histidines
Figure 84 : Brève représentation de la purification en batch sur colonnes glutathion et Ni-NTA
La protéine purifiée ainsi que des échantillons prélevés au cours de la purification sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les protéines déposées migrent sous l’effet d’un courant électrique. La protéine ainsi qu’un marqueur de
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tailles sont chacun mélangés à une solution dénaturante puis déposés dans les puits du gel. Après migration, on peut observer le contenu protéique des échantillons séparés en fonction de leurs poids moléculaire. A l’issue de cette migration, le gel est visualisé suite à sa coloration au bleu de coomassie suivi de sa décoloration, la coloration des protéines étant irréversible. Enfin, la protéine subit des dialyses, à l’issue desquelles elle est dosée à l’aide de la technique de Bradford afin d’évaluer la concentration protéique totale.
2.Détection de l’activité HAT
Après expression de la protéine, l’activité enzymatique de cette dernière est évaluée. Plusieurs méthodes permettent de déceler l’activité HAT d’enzyme recombinante : par une méthode radioactive, par une méthode spectrophotométrique en continu ou en discontinu et enfin par une méthode de fluorescence.
La méthode radioactive (Mizzen et al, 1999), implique l’utilisation d’3[H]-
acétylcoenzyme A ou d’14[C]-acétylcoenzyme A. Cette méthode détecte la quantité de
substrat 3[H]-acétylé ou 14[C]-acétylé à la fin de la réaction d’acétylation. Cette réaction est
stoppée en déposant le milieu réactionnel sur du papier filtre P81 (Whatman) qui retient les histones basiques. Ce papier est lavé puis mis en contact avec du liquide de scintillation avant le comptage de la radioactivité. Cette méthode est très sensible mais nécessite une organisation spécifique à la manipulation de la radioactivité (personne habilitée, établissement agréé)
La méthode spectrophotométrique en continu, où système d’enzyme couplée (Kim et al, 2000), permet de doser indirectement le coenzyme A formé au cours de la réaction d’acétylation (Figure 85). Pour cela, la réaction d’acétylation est réalisée en présence d’une autre enzyme, l’α-cétoglutarate déshydrogénase (ou la pyruvate déshydrogénase), de son substrat, l’α-cétoglutarate (ou le pyruvate) et de son co-facteur, la nicotinamide adénosine dinucléotide NAD+. Lors de la réaction, NAD+ est réduit en NADH. Ce produit absorbe à 340
nm (ε = 6230 M-1.cm-1) et sa formation est suivie par spectrophotométrie UV-visible. Ce
protocole a été mis au point pour les HATs GCN5 et PCAF. Dans le cas d’une autre HAT, il serait nécessaire de mettre au point les conditions optimales d’expérience. Ce test présente
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l’avantage d’être en continu, mais il est fort possible qu’en présence d’inhibiteur de HAT, l’enzyme couplée soit également inhibée.
HSCoA + NAD+ + a-cétoglutarate déshydrogénase α-cétoglutarate ou pyruvate pyruvate déshydrogénase ou succinyl-CoA+ NADH +CO2+ H+ Acétyl-CoA + NADH + CO2 + H+
ε
340 nm = 6230 M-1.cm-1 AcétylCoA + histone HAT HSCoA + AcétylhistoneFigure 85 : Détection de l’activité HAT à l’aide du système d’enzyme couplée (Kim et al, 2000)
La méthode de détection par fluorescence met en jeu un fluorophore qui est couplé soit au substrat (Wu & Zheng, 2008), soit avec le coenzyme A formé (Trievel et al, 2000a). Dans le cas du peptide fluorescent, l’acétylation du peptide entraîne une augmentation de l’intensité de fluorescence. Dans le second cas, le produit de réaction entre le coenzyme A et le fluorophore (ex : 7-diéthylamino-3-(49-maléimidylphényl)-4- méthylcoumarine CPM) donne un adduit qui fluoresce fortement. La détection de l’activité HAT par fluorescence est une méthode sensible mais qui nécessite un matériel et un protocole adapté.
La dernière méthode présentée est spectrophotométrique, elle permet de suivre, de façon discontinue, la formation du coenzyme A formé au cours de la réaction d’acétylation. L’activité de l’enzyme est décelée à l’aide d’un test basé sur la réaction entre l’acide 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoïque (DTNB) et le groupement thiol du coenzyme A libéré lors de la réaction d’acétylation catalysée par p300 (Thompson et al, 2004) (Figure 86). L’acide 2-nitro-5-thiobenzoïque (NTB, ε = 13 600 M-1.cm-1) produit est jaune vif et peut être détecté λ
115 S S NO2 COO NO2 COO + coenzyme A NO2 COO S S CoA NO2 COO S- + NTB jaune vif 13 600 M-1.cm-1 DTNB
Figure 86 : Réaction du DNTB en présence de thiols
La méthode utilisée pour détecter l’activité HAT de p300 est celle employant le DTNB. Cette méthode est simple et le protocole a été décrit pour p300 (Thompson et al, 2004).
3.Témoins positifs et négatifs
Afin d’écarter toute erreur au niveau du test d’activité et ainsi rendre fiables les résultats qui en découlent, plusieurs contrôles ont été réalisés (Tableau 16).
La solution d’acétylcoenzyme A est préparée dans le tampon PCAB (cf partie expérimentale) puis est stockée. Un test constitué de tampon PCAB (pH 7,9), d’acétylcoenzyme A et d’un mélange d’histones permet de vérifier d’une part que l’acétylcoenzyme A n’est pas hydrolysé et d’autre part qu’il n’y a pas d’hydrolyse pendant la durée de l’expérience. Ce test est réalisé régulièrement pour contrôler les solutions d’acétylcoenzyme A stockée à -80°C. Les solutions d’acétylcoenzyme A se conservent plusieurs mois à -80°C et aucune hydrolyse spontanée n’a été observée durant les expériences.
L’étape suivante consiste à vérifier que le test fonctionne dans nos conditions. Pour cela, un test HAT est réalisé avec un mélange d’HATs (extrait nucléaire de cellules HeLa, HNE), en présence d’un mélange d’histones et d’acétylcoenzyme A. Ce test s’est révélé positif et cette expérience a servi de témoin positif.
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Un témoin négatif est aussi nécessaire. Pour cela, la solution de guanidinium dénaturante (solution Q) est ajoutée avant l’extrait à tester et le milieu est ensuite incubé à 30°C. Puis, seule la solution de DTNB est ajoutée et la DO est alors relevée. Le témoin négatif peut aussi être réalisé avec de l’enzyme dénaturée par chauffage (10 min à 95°C).
Lors de la purification, du surnageant, obtenu après lyse et séparation de l’enzyme des débris cellulaires, est prélevé. Ainsi, avant de poursuivre avec l’étape de purification, l’activité HAT du surnageant est contrôlée.
Contrôle 1 PCAB + acétylCoA + histones
Contrôle 2 : témoin positif PCAB + acétylCoA + histones + HNE
Contrôle 3 : témoin négatif
PCAB + acétylCoA + histones (ou substrats) + dénaturant + extrait à tester
PCAB + acétylCoA + histones (ou substrats) + extrait à tester dénaturé
Contrôle 4 : témoin positif PCAB + acétylCoA + histones + surnageant Tableau 16 : Les différents contrôles et témoins (à ces solutions sont ajoutées la solution Q et la
solution de DTNB avant la mesure de DO)
Par la suite, le mélange d’histones ne sera plus utilisé comme substrat. En effet, la composition du mélange d’histones n’est pas connue avec précision et le substrat doit être identifié pour les expériences d’enzymologie. Le peptide qui sera utilisé est issu de l’histone H4 et contient les acides aminés 14 à 21 (H4-8 : Ac-GA16KRHR20KV-NH
2) de sa partie N-
terminale. Il a été vérifié que ce peptide est substrat de p300 (Kervabon et al, 1979).