Para o teste bactericida foi realizado um método padrão para análise de atividade bactericida. O seguinte microorganismo foi utilizado: E. coli (ATCC 25922), a qual é Gram–negativa. E. coli foi escolhida porque bactérias Gram-negativas são responsáveis por mais de 80 % de todas as infecções [3].
Primeiramente as bactérias encontradas em estoque foram inoculadas em meio liquido (caldo nutriente), por um período de 24 horas à temperatura de 37 °C. Após esse período as bactérias crescidas foram inoculadas em Agar Nutriente (0,1 % Agar), para formação de colônias e avaliação da pureza da linhagem bacteriana pelo mesmo período de tempo e igual temperatura.
Após este processo de ativação, as culturas foram crescidas em 100 mL de Caldo Nutriente (meio rico) em frascos de 250 mL durante 24 horas a 37 °C. Para realização do experimento foram utilizadas 10 repetições para cada tratamento, sendo esse o mínimo necessário para se obter resultados estatisticamente precisos.
As alíquotas retiradas foram de 300 µL, tanto do meio de cultura quanto do meio estéril para a realização do procedimento conforme a tabela 4.1.
Tabela 4.1 Tratamentos utilizados para avaliar efeito bactericida/ bacteriostático do filme fino (fase 1)
Tratamento Filme fino Pré- esterilização
Cultura de bactéria
1 Sim Sim Sim
2 Sim Sim Não
3 Não Sim Sim
4 Não Sim Não
5 Sim Não Sim
Os tratamentos foram incubados durante 24 horas numa estufa a 37 °C, após esse período realizou-se as leituras das absorbâncias, 100 µL foram retirados das amostras e adicionados 900 µL de salina 0,9 %, sendo realizadas as leituras em espectrofotômetro a 600 nm. A tabela 4.1 pode ser representada pela figura 4.2 a seguir:
Figura 4.2 Representação esquemática da fase 1 do experimento.
Para a continuidade do experimento, alíquotas de 100 µL dos tratamentos anteriores foram inoculadas em tratamentos sem o filme fino (tabela 4.2), com pré- esterilização, adicionando 200 µL de meio de cultura e estéril, o experimento foi incubado durante 24 horas a 37 °C. Leituras foram realizadas em espectrofotômetro como descritas anteriormente.
Tabela 4.2 Tratamentos utilizados para avaliar efeito bactericida/ bacteriostático do filme fino (fase 2).
Tratamento Filme fino Pré- esterilização
Cultura de bactéria
1 Não Sim Sim
2 Não Sim Não
3 Não Sim Sim
4 Não Sim Não
5 Não Não Sim
Desta forma, foi possível avaliar a bioatividade de filmes finos e ultrafinos de dióxido de titânio em substrato vítreo obtido via processo de impregnação forçada por controle de pressão e de temperatura
A fase 2 do experimento foi realizada com o objetivo de averiguar se o filme formado é bactericida ou bacteriostático, onde um aumento nos valores obtidos de leituras de absorbância indica um crescimento das bactérias (ou seja, o filme é bacteriostático), já se os valores se mantiverem próximos e/ou iguais podem indicar a morte e inativação das bactérias (filme bactericida).
Classificou-se ainda os tratamentos e as fases 1 e 2 conforme a tabela 4.3 a seguir:
Tabela 4.3 Tabela comparativa entre tratamentos para analise da bioatividade.
Ensaio Resultado Hipótese
3-1 3>1 Taxa de sobrevivência – com inibição
3-1 3=1 Taxa de sobrevivência – sem inibição
2 - Controle qualidade do filme
3 100% Controle qualidade da bactéria
4 0% Controle qualidade do meio
Fase 1 = Fase 2 Estatisticamente
significante Filme bactericida
Fase 1< Fase 2 Estatisticamente
5 Resultados e Discussões
Para a determinação da composição do pó utilizado utilizou-se as técnicas de difração de raios X (Figura 5.1) e microscopia eletrônica de varredura (Figura 5.2), respectivamente.
Figura 5.1 Difratograma de raios X de amostra do pó de TiO2 em substrato
vítreo.
O difratograma representado na figura 5.1 serve para caracterizar a composição monofásica do óxido utilizado, onde pode se perceber os picos característicos do TiO2 puro na fase rutilo com base nos cartões JCPDS (“Joint
E através do difratograma (Figura 5.1) pode-se calcular o tamanho médio de cristalito do pó pela equação de Scherrer (equação 4.1). Onde o dióxido de titânio apresentou um tamanho médio de cristalito, na ordem de 11,4 nm.
A micrografia da figura 5.2 apresenta a morfologia do dióxido de titânio, quando caracterizado por MEV.
Figura 5.2: Microscopia eletrônica de varredura do pó de TiO2
Após a preparação do substrato e deposição do filme através da metodologia já descrita nesse trabalho, foi possível caracterizar o filme fino de TiO2 com a técnica
de difração de raios X em baixo ângulo (figura 5.3) e os resultados, comparados aos cartões JCPDS (“Joint Committee on Powder Diffraction Standards”).
Figura 5.3 Difratograma de raios X de amostra de filme fino de TiO2 em
substrato vítreo.
Os picos do difratograma da figura 5.3 são indicativos da presença do filme na forma de óxido para o pó utilizado, o TiO2, e indicam novamente a fase tetragonal
rutilo. Sabe-se que a superfície do filme resultante é diretamente influenciada pela morfologia do pó utilizado, sendo que o pó fino, de preferência nanopós, é impregnado com maior êxito devido a sua elevada reatividade e área de superfície, o que facilita a formação do filme na superfície do substrato devido a uma nucleação mais rápida [1].
A propriedade morfológica do filme fino de TiO2, foi avaliada por microscopia
de “field emission gun‖ (FEG) e está representada nas figuras 5.4 e 5.5.
A figura 5.4 é uma seção transversal do substrato vítreo, onde se pode analisar a espessura nanométrica do filme fino formado.
Figura 5.4. Microscopia de FEG do filme fino de TiO2 formado em substrato
vítreo, vista lateral do substrato.
Já na figura 5.5 tem-se uma imagem da superfície do substrato, representada pelas partículas de dióxido de titânio que recobrem a superfície do substrato vítreo.
Figura 5.5 Microscopia de FEG do filme fino de TiO2 formado em substrato
vítreo, vista da superfície do filme.
A figura 5.4 comprova a formação do filme fino e sua possível espessura que é muito inferior a 45 nm, podendo assim, ser considerado filme ultrafino. Já na figura 5.5 é possível analisar a morfologia desse filme de TiO2.
Sugere-se que a formação do filme fino ocorre devido à troca iônica induzida, gerando um aumento na cristalização vítrea, onde os íons do óxido utilizado substituem alguns átomos presentes na rede do vidro, desde que estejam em concentrações apropriadas, que por sua vez, resultam no aumento da solubilidade em relação aos cristais formadores do vidro [64].
Isto afeta o equilíbrio termodinâmico do sistema formador do vidro, o qual, acima da Tg é considerado um equilíbrio metaestável (solução líquida), levando a
correspondentes [63]. Neste caso, o vidro fundido e a formação de sais de sódio solúveis facilitam a impregnação de pós na superfície vítrea [64].
O aparecimento dos pequenos grãos de óxidos na superfície do vidro está em conformidade com a dimensão do óxido utilizado. Desta forma, acredita-se que, ao mesmo tempo em que a pressão exerce a função de gerar o contato da interface, a temperatura e o tempo são facilitadores da difusão dos grãos de óxidos na superfície do vidro.
Após a obtenção do filme fino e a comprovação de sua formação, foram realizados os testes para analisar a bioatividade do filme de TiO2.
Primeiramente analisou-se o crescimento da Escherichia coli com ausência de inibidores, para se obter uma curva de crescimento padrão na qual é possível analisar as fases de crescimento bacteriano (Figura 5.6). A cultura foi padronizada partindo de uma absorbância inicial de 0,05 nm, acompanhou-se o crescimento da bactéria, retirando alíquotas de 1000 µL a cada duas horas para realizar novas leituras.
Figura 5.6 Curva de crescimento padrão bacteriano para a E. coli.
É possível observar na curva, que a E. coli não apresentou a fase lag, fase em que a bactéria se adapta ao meio e o crescimento é lento, isto se deve ao fato da cultura ter sido previamente crescida em outro meio antes da padronização para o inicio da curva.
Outro comportamento da E. coli observado é seu rápido crescimento, pois em aproximadamente 6 horas após a inoculação ela já se apresentava em fase estacionária, onde a divisão celular decresce a um ponto em que novas células são produzidas com a mesma velocidade com que as células antigas morrem, e o meio contém uma quantidade limitada de nutrientes e podendo conter resíduos tóxicos.
É possível também analisar a morfologia da Escherichia coli através da microscopia eletrônica de varredura (Figura 5.7).
Figura 5.7 Microscopia eletrônica de varredura da E. coli [67]
Ao observar a figura 5.7 é possível ver a forma característica de bacilo da Escherichia coli. Os bacilos têm forma de bastonetes, podendo apresentar extremidades retas (Bacillus anthracis), arredondadas (Salmonella, E. coli), ou ainda afiladas (Fusobacterium). Como seu plano de divisão é fixo, ocorrendo sempre no menor eixo, os bacilos exibem uma menor variedade de arranjos, sendo, via de regra encontrados isolados, como diplobacilos ou ainda como estreptobacilos [62].
O tamanho e a forma de algumas bactérias pertencentes à mesma categoria podem variar, pois dependem dos nutrientes presentes no meio. Por exemplo, num meio abundante de nutrientes a divisão celular é rápida e os bastonetes são freqüentemente duas vezes maiores do que aqueles em meios com suprimento moderado de alimentos.
Depois de observar a morfologia da bactéria apresentada pela literatura na figura 5.7 e da análise do crescimento da E.coli, pode-se testar a bioatividade do filme e para isso foram realizadas 10 repetições para cada tratamento (descritos no item 4.4 - etapa 4). Após o período de crescimento de 24 horas em uma estufa a 37 ºC, realizaram-se as leituras de absorbâncias da primeira fase dos tratamentos, conforme a tabela 5.1, que traz os dados de um dos experimentos realizados.
Tabela 5.1 Valores de absorbância encontrados para os tratamentos na fase 1 (absorbância x 102 E ±10-4). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 2,0 0,0 2,5 0,5 1,0 2,0 0,0 1,5 0,5 1,0 1,5 0,0 2,5 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0 0,0 1,0 1,0 0,5 1,5 0,0 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 1,0 0,5 1,5 2,0 0,5 3,0 0,0 2,0 0,5 0,0 2,5 0,0 1,0 2,0 0,0 2,5 0,5 2,0
Os resultados encontrados na tabela 5.1, apresentam os valores de absorbância encontrados após um período de crescimento das bactérias. Nota-se que os controles de meio estéril tratamento 2 (filme + meio estéril + esterilização) e tratamento 4 (sem filme + meio estéril + esterilização) apresentaram valores entre 0 e 1,5x102 nm, mostrando assim que a contaminação externa foi mínima nos tratamentos.
Os valores do tratamento 3 (sem filme + cultura + esterilização - média de 1,9 x102 nm) mostram um maior crescimento das bactérias se comparado com o número 1 (filme + cultura + esterilização - média de 1,5 x102 nm) e o número 5 (filme + cultura + sem esterilização média de 1,3 x102 nm). Porém esses valores não trazem a quantidade aproximada de células existentes nas alíquotas retiradas.
Os valores de absorbância então foram multiplicados por 109 para encontrar o número de células de E. coli existentes em cada tratamento, conforme a tabela 5.2.
Tabela 5.2 Número de células em cada tratamento na fase 1 (Absorbância X 107 E ±105). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 2,0 0,0 2,5 0,5 1,0 2,0 0,0 1,5 0,5 1,0 1,5 0,0 2,5 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0 0,0 1,0 1,0 0,5 1,5 0,0 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 1,0 0,5 1,5 2,0 0,5 3,0 0,0 2,0 0,5 0,0 2,5 0,0 1,0 2,0 0,0 2,5 0,5 2,0
A partir do número de células tornou-se possível analisar os resultados da ação do filme, porém o cálculo do log faz com que a análise tenha maior precisão.
Desta forma, calculou-se a somatória do log (tabelas 5.3) para efeito de comparação com a fase 2 (repetição dos tratamentos da fase 1 na ausência de filme).
Tabela 5.3 Log dos resultados e somatória do log para a fase 1 do experimento ( E ±10-1). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 7,3 0,0 7,4 6,7 7,0 7,3 0,0 7,2 6,7 7,0 7,2 0,0 7,4 6,7 7,0 7,2 7,0 7,0 0,0 7,0 7,0 6,7 7,2 0,0 7,2 7,2 7,2 7,2 6,7 7,0 7,0 6,7 7,0 6,7 7,2 7,3 6,7 7,5 0,0 7,3 6,7 0,0 7,3 0,0 7,0 7,3 0,0 7,3 6,7 7,3 ∑ 71,5 34,3 72,5 40,2 71,0
Realizou-se então a segunda etapa da análise da bioatividade do TiO2
(fase 2), agora os tratamentos foram realizados na ausência de filme fino a fim de se obter resultados que comprovassem o efeito bactericida e/ou bacteriostático do filme. Sendo que um aumento nos valores obtidos das leituras da absorbância indica um crescimento das bactérias, já se os valores se mantiverem próximos e/ou iguais podem indicar a morte ou o não crescimento das bactérias, podendo assim realizar uma classificação da bioatividade do filme.
A tabela 5.4 traz os resultados das leituras de absorbância para a fase 2 do experimento realizado após um período de 24 horas numa estufa a 37ºC com ausência de filme fino.
Tabela 5.4 Valores de absorbância encontrados para os tratamentos na fase 2 (absorbância X 102 E ± 10-4). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 0,5 0,0 3,0 2,0 4,5 3,0 1,0 4,0 0,5 3,0 3,0 2,0 2,0 1,0 1,0 3,0 0,0 3,0 0,0 1,5 1,0 1,5 2,5 5,0 3,0 5,0 1,0 3,5 1,0 2,5 1,0 0,0 2,0 0,0 1,5 1,5 0,5 1,5 1,0 1,5 1,0 0,0 5,0 0,0 4,0 1,5 1,0 2,0 0,0 1,0
Dos resultados de absorbância obtidos para a fase 2 podemos perceber que o crescimento das bactérias no tratamento 1 (sem filme + cultura + esterilização na fase 2 - média de 2,0 x102 nm) é estatisticamente insignificante, sendo a diferença entre a fase 1 (com filme) e a fase 2 (sem filme) é de aproximadamente 0,5 x102 nm.
No experimento 3 (sem filme + cultura + esterilização), as bactérias continuam a crescer, comparando-se a fase 1 (tratamento 3 sem filme - 1,9 x102 nm) com a fase 2 (tratamento 3 sem filme – 2,8 x102 nm). Já no experimento 5 (sem filme + cultura + sem esterilização na fase 2), onde não é realizada a esterilização do substrato vítreo, acredita-se que este seja o motivo do aumento da concentração de células bacterianas, pois o substrato sem filme adicionado pode estar contaminado e quando em contato com um meio rico em nutrientes desenvolve o crescimento desses organismos presentes em sua superfície, interferindo assim no resultado, onde a fase 1 (com filme - 1,3 x102 nm) possui um ótimo resultado, em contraste a fase 2 (sem filme – 2,3 x102 nm) mostra um grande aumento no valor da absorbância, comparado com o tratamento 1 (sem filme + cultura + esterilização) na fase 2, no qual é realizada esterilização.
Novamente multiplicaram-se os valores de absorbância por 109 para se obter o número de células existente, conforme tabela 5.5
Tabela 5.5 Número de células em cada tratamento na fase 2 (Absorbância X 107 E ± 105). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 0,5 0,0 3,0 2,0 4,5 3,0 1,0 4,0 0,5 3,0 3,0 2,0 2,0 1,0 1,0 3,0 0,0 3,0 0,0 1,5 1,0 1,5 2,5 5,0 3,0 5,0 1,0 3,5 1,0 2,5 1,0 0,0 2,0 0,0 1,5 1,5 0,5 1,5 1,0 1,5 1,0 0,0 0,5 0,0 4,0 1,5 1,0 2,0 0,0 1,0
Assim, pode-se calcular o log e a somatória do log dos resultados para a fase 2. (tabela 5.6)
Tabela 5.6 Log dos resultados e somatória do log para a fase 2 do experimento (E ±10-1). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 6,7 - 7,5 7,3 7,7 7,5 7,0 7,6 6,7 7,5 7,5 7,3 7,3 7,0 7,0 7,5 - 7,5 - 7,2 7,0 7,2 7,4 7,7 7,5 7,7 7,0 7,5 7,0 7,4 7,0 - 7,3 - 7,2 7,2 6,7 7,2 7,0 7,2 7,0 - 7,7 - 7,6 7,2 7,0 7,3 - 7,0 ∑ 72,3 42,2 74,3 42,7 73,3
Os cálculos relatados anteriormente foram feitos para todos os experimentos realizados. Após um número significativo de experimentos, calculou-se a média das somatórias encontradas para uma analise global da bioatividade do filme fino de TiO2. Sendo a média encontrada relatada na tabela 5.7.
Tabela 5.7 Média das somatórias dos experimentos analisados (E ± 10-1). Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 3 Tratamento 4 Tratamento 5 Média da ∑ Fase 1 70,9 36,0 70,8 36,0 64,0 Média da ∑ Fase 2 73,7 44,0 75,0 41,0 74,0
E a partir da média dos experimentos realizados foi possível construir um gráfico que representa o efeito do filme sobre as bactérias. (Figura 5.8)
Figura 5.8 Média das somatórias dos experimentos.
Se comparado a fase 1 dos tratamentos 1, 3 e 5: sendo o tratamento 1 (filme fino + cultura + esterilização), o tratamento 3 (sem filme fino + cultura + esterilização) e o tratamento 5 (filme fino + cultura + sem esterilização), é possível notar a inibição que o filme provoca no crescimento da bactéria ao longo de um período de 24 horas. Outro fator importante a ser analisado é o efeito de inibição do
filme no tratamento 5 (filme fino + cultura + sem esterilização) ser maior que no tratamento 1 (filme fino + cultura + esterilização), acredita-se que isso se deve pelo fato de que ao esterilizar a lamínula através da flambagem, haja uma perda de radicais livres na superfície, que reagem com o oxigênio, tornando-se mais estáveis, tendo assim uma perda efetiva da ação do filme, uma vez que, como já relatado, sabe-se que o possível mecanismo de ação do TiO2 são os radicais livres que
afetam a superfície da membrana externa da bactéria, causando danos, deixando-as expostas ao meio ambiente.
Com a obtenção da média dos resultados foi possível então comparar a fase 1 (com filme fino) do experimento com a fase 2 (repetição dos tratamentos da fase 1 na ausência de filme) e classificar os tratamentos em
Taxa de sobrevivência – com inibição: as bactérias apresentam um desenvolvimento maior em um meio sem a presença de filme, podendo representar uma diminuição do metabolismo das bactérias quando há presença do filme de TiO2.
Taxa de sobrevivência – sem inibição: o desenvolvimento da bactéria é igual quando comparado a presença ou não de um filme, ou seja, as bactérias não apresentam inibição na presença do filme de TiO2.
Controle de qualidade do filme fino, ou seja, se todos os cuidados durante o processo de impregnação do filme fino foram tomados, se os filmes foram realmente formados e se o processo de limpeza desses materiais foi eficiente. Controle de qualidade da bactéria, no momento em que a bactéria foi ativada, se não ocorreu nenhum erro de natureza humana, e/ou a avaliação da taxa de crescimento da bactéria.
Controle de qualidade do meio, se o meio foi contaminado podendo alterar os resultados a serem obtidos.
Filme fino bactericida, as bactérias não sobrevivem ao meio, e quando retiradas não voltam a crescer, considerando-se assim, possível eficiência do TiO2.
Filme fino bacteriostático, as bactérias têm o seu crescimento interrompido pelo filme, porém quando retidas de cima desse substrato e colocadas em outro meio livre de filme, voltam a crescer e se desenvolver.
Essa classificação foi resumida anteriormente na tabela 4.3 nos materiais e métodos.
Conclui-se então que o filme fino de TiO2 apresenta características
bacteriostáticas, pois a média do tratamento 1 (filme fino + meio de cultura) apresenta os valores estatisticamente significantes da fase 1 (com filme fino) menores que da fase 2 (sem filme fino). Outro dado importante é a comprovação da inibição da bactéria, sendo os valores obtidos para o tratamento 3 (sem filme fino + cultura + esterilização) são maiores que do tratamento 1(filme fino + cultura + esterilização). Os outros tratamentos realizados serviram apenas de controles para analise das condições do experimento, como controle da qualidade do meio, qualidade do filme fino e a qualidade da própria cultura de bactéria utilizada.
Uma explicação para o efeito bacteriostático encontrado pode ser sugerida devido ao fato de o dióxido de titânio encontrar-se na fase rutilo, forma mais estável e por isso possuir uma menor quantidade de radicais livres disponíveis, porém, o resultado se mostra satisfatório, uma vez que, até então nenhum estudo traz informações sobre o poder de inibir o crescimento de bactérias com a fase rutilo. Já o efeito bactericida do dióxido de titânio na fase anatase é relatado em diversos
estudos que comprovam o seu efeito, embora o mecanismo de inativação da bactéria também seja parcialmente desconhecido.
Sendo a infecção hospitalar, também conhecida como infecção nosocomial (causada em muitos casos pela Escherichia coli), uma preocupação mundial, onde dados mostram que em média 10 % dos pacientes admitidos, adquirem uma infecção, aumentado a duração da permanência no hospital e o custo do tratamento. E ainda, destes 10 % (cerca de 2 milhões de pacientes), 20.000 morrem em decorrência dessas infecções [62]. O estudo traz grandes benefícios à sociedade, pois enquanto o uso indiscriminado de antibióticos contribui para o desenvolvimento de bactérias patogênicas mais resistentes, a ação do filme fino não aumenta essa resistência, sendo seguro e com ação efetiva, pois uma vez atacada à membrana externa de uma bactéria, a mesma se torna incapaz de se reproduzir e acaba ficando fragilizada perante condições ambientais.
6. Conclusão
O método de impregnação forçada por alta pressão e alta temperatura foi uma técnica aplicada com sucesso na fabricação de filmes finos de dióxido de titânio (TiO2) em substrato vítreo.
Como mostrado em estudos anteriores [66], diferentemente de outros métodos existentes, nesse o TiO2 passa a fazer parte da estrutura do substrato,
fazendo com que o filme tenha a mesma vida útil que o substrato.
O TiO2 na fase rutilo, mais estável, também mostrou-se capaz de inibir o
crescimento da bactérias, assim como a fase anatase relatada em outros trabalhos. Sugere-se que o TiO2 rutilo ataca a membrana externa da bactéria deixando a
membrana interna exposta, inibindo a formação de uma nova parede, interferindo na síntese protéica, o que faz com ela seja incapaz de se reproduzir novamente, e fique exposta as condições ambientais, levando a sua morte. A diferença de comportamento é justificada devido ao elevado grau de desordem da fase anatase em relação à fase rutilo.
Foi observado um excelente desempenho do filme fino de TiO2 contra a
Escherichia coli Gram-negativa, podendo esses filmes finos serem utilizados como azulejos bacteriostáticos/bactericidas em hospitais, residências, cozinhas industriais, etc.
7. Sugestões para trabalhos futuros
Sendo a metodologia utilizada neste trabalho um grande diferencial na fabricação de filmes finos, e com a obtenção de resultados favoráveis para o óxido estudado, é viável a exploração desta linha de pesquisa nas mais diversas aplicações. Podendo-se se sugerir os seguintes trabalhos futuros:
1. Comparação do efeito do TiO2 com prata e ouro.
2. Testar novos óxidos e suas bioatividades
3. Substituição do substrato vítreo por outros materiais
8 Referências
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precursores metalorgânicos: uma técnica química de obtenção de filmes finos, Química Nova, vol. 25, pp. 69-77, 2002.
[3] SAYER, M. and SREENIVAS, K., Ceramic Thin Films: Fabrication and Applications, Science, vol. 247, pp. 1056-1060, 1990.
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