Partie V – Résultats : Purification de la porine yVDAC1 de S cerevisiae
V. D.3.4 Expression de yVDAC1-HT par la lignée V-HT
L’expression de la protéine yVDAC1-HT par la lignée V-HT en milieu YPL à 28°C est vérifiée par Western blot avec des anticorps dirigés contre la porine et contre l’étiquette polyhistidine qu’elle porte à son extrémité C-terminale. Une bande protéique, située
légèrement au-dessus de 30 kDa, est bien révélée sur le gel. Cette analyse permet également de comparer les niveaux d’expression des protéines pour les différentes souches cultivées dans les mêmes conditions : celui de yVDAC1-HT dans la souche V-HT apparaît plus faible que celui de la porine yVDAC1 dans la souche parentale DBY 747 (cf Figure 37).
Le promoteur PMA1, qui est pourtant fortement activé durant la phase exponentielle de croissance en milieu non fermentescible (Fernandes et Sa-Correia, 2003), ne permet donc pas de surexprimer la porine étiquetée. Un résultat similaire a été obtenu au laboratoire dans un travail auquel j’ai participé et qui se rapporte à l’expression homologue de la protéine chimérique yAnc2-Cyc1-HT sous contrôle du promoteur PMA1 (Rey et al., 2007). Cela indique probablement une limitation dûe à la machinerie d’import des protéines dans la mitochondrie, peut-être liée à la charge négative élevée de l’étiquette polyhistidine. Il n’est pas non plus exclu que ce faible niveau d’expression soit lié à la perte du plasmide par certaines des cellules, qui, en l’absence de pression de sélection, redeviennent alors des cellules de type ΔPor et n’expriment plus de porine. Pour éviter ce problème, il faudrait cultiver la souche V-HT en milieu sélectif lactate carencé en tryptophane. Malheureusement, ceci est difficile car les cellules de la souche V-HT forment des agrégats dans ce milieu. Quoi qu’il en soit, le coût de tels milieux est prohibitif pour des cultures de levure à grande échelle.
Figure 37 : Comparaison des niveaux d’expression de yVDAC1 et yVDAC1-HT. Des mitochondries, isolées à partir de cellules des souches DBY 747, ΔPor et V-HT, cultivées en milieu YPL à 28°C, ont été solubilisées en présence de SDS. Des quantités équivalentes de protéines totales ont été soumises à une électrophorèse sur gel d’acrylamide en conditions dénaturantes. Les protéines ont ensuite été immunodétectées par les anticorps α-yVDAC1 (1:3000) et α-HT (1:3000). Pour une comparaison correcte, le transporteur d’ADP/ATP a été pris comme référence interne (anticorps α-yAnc2 (1:2000)). Il faut noter l’absence attendue de la porine dans la souche ΔPor.
Il est important de noter que, pour une même souche de S. cerevisiae, les cellules cultivées sur un milieu fermentescible contiennent moins de mitochondries que celles qui se développent sur un milieu non-fermentescible. Un meilleur taux d’expression est donc attendu
en milieu YPL plutôt qu’en milieu YPD, et c’est pourquoi nous avons comparé les niveaux d’expression de la porine étiquetée (souche V-HT) et de la porine native (souche parentale DBY 747 et souche W303-1B) dans des cellules de ces trois souches cultivées sur milieu YPL. Pour cela, nous avons évalué la quantité de porine dans les lysats mitochondriaux correspondants par immunodécoration, en utilisant l’anticorps α-yVDAC1 comme anticorps primaire (cf Figure 38). Dans le but de quantifications plus précises, nous avons également tenté le marquage chimique de yVDAC1-HT par le DCCD radiomarqué ([14
C]- dicyclohexylcarbodiimide), comme cela a été rapporté pour la porine de rat (Nakashima et al., 1986). Malheureusement, nous n’avons pas mis en évidence ce marquage dans le cas de la porine de levure.
Il ressort des expériences d’immunodécoration que la quantité de porine étiquetée produite dans les mitochondries provenant de la souche V-HT représente environ 0,5% des protéines mitochondriales totales tandis qu’elle est proche de 1% et de 2% respectivement pour la porine mitochondriale des souches DBY 747 et W303-1B. Etant donné que la souche W303-1B exprime davantage de porine que la souche DBY 747, et qu’elle se prête bien à la recombinaison homologue, il serait envisageable de construire un mutant ΔPor à partir de la souche W303-1B puis d’insérer dans son génome le gène codant pour yVDAC1-HT par recombinaison homologue, afin d’obtenir la porine étiquetée en plus grandes quantités.
Figure 38 : Evaluation quantitative par immunodécoration de la quantité de porine présente dans les lysats mitochondriaux.
Sur le gel d’électrophorèse ont été déposés 30 µg de protéines mitochondriales totales de chacune des trois souches (en bleu). Des quantités connues de porine yVDAC1-HT, purifiée suivant le protocole établi et décrit à la partie V.E., ont été déposées : elles forment une gamme étalon de référence. Le résultat est analysé par Western blot, avec l’anticorps primaire α-yVDAC1 dilué au 1:30000.
Afin de contrôler si la porine yVDAC1-HT peut, dans les cellules de levure de la souche V-HT, être observée dans d’autres organites que les mitochondries, nous avons effectué l’analyse par Western blot du surnageant provenant de la lyse des sphéroplastes par la Zymolyase 20T (Seikagaku Corporation). Ceci ne nous a pas permis d’observer de localisation extramitochondriale de yVDAC1-HT, rapportée pour d’autres types cellulaires et au centre de polémiques (Bathori et al., 2000). En revanche, de grandes quantités de protéine yAnc2 largement fragmentée ont été visualisées après immunodécoration. Il pourrait s’agir de protéine issue de la dégradation du transporteur, ou bien, plus probablement, de la reconnaissance non-spécifique d’une protéine non-mitochondriale par l’anticorps α-yAnc2, dont la spécificité n’a été vérifiée qu’au niveau des mitochondries et qui a de plus été utilisé à des concentrations peut-être trop importantes.
Figure 39 : Présence extramitochondriale de yVDAC1-HT ?
Analyse par Western blot, avec les anticorps α-yAnc2 (1:2000, A) et α-yVDAC1 (1:3000, B), de mitochondries solubilisées par du SDS (1) et de surnageant provenant de la lyse des sphéroplastes par la Zymolyase 20T, après ultracentrifugation, et solubilisation du culot résultant dans du SDS (2).