D´ etection directe

6.3.5.1. Preparação de DVS-agarose.

Divinilsulfona (1,5 mL) foi adicionada à 40 mL de uma solução de carbonato de sódio 333 mM a pH 12,5 e agitada até a mistura se tornar-se homogênea. Em seguida, 2 g de agarose foram adicionados e deixados sob agitação suave durante 35 minutos (Capítulo 3 desta tese). Finalmente, o suporte ativado foi lavado com um excesso de água destilada e armazenado a 4 °C.

6.3.5.2 Imobilização de CALB em DVS-agarose.

Uma porção de 10 g de suporte foi suspenso em 100 mL de soluções de CALB (concentração máxima de proteína foi de 1 mg / mL) a 25 °C utilizando 10 mM de diferentes tampões (acetato de sódio a pH 5, fosfato de sódio a pH 7 ou carbonato de sódio a pH 10). Em alguns casos, triton X100 (0,1% v/v) foi adicionado. Em outros casos, as preparações de lipase imobilizada foram filtradas e uma porção dos derivados foi incubada em 100 mL de tampão bicarbonato de sódio 100 mM a pH 10,0 e 25 °C durante 72 h.

Como um ponto final da reação enzima/ suporte, todos os biocatalisadores imobilizados foram incubados em EDA 1M a pH 10 e 25 °C durante 24 h para bloquear os grupos reativos restantes no suporte (este foi o melhor reagente de bloqueio para a enzima quimotripsina quando se usou este suporte) (Capítulo 3 desta tese). Finalmente, a preparação imobilizada foi lavada com um excesso de água destilada e armazenada a 4 °C.

6.3.5.3. Inativação térmica de diferentes preparações de CALB imobilizada

Para verificar a estabilidade dos diferentes derivados de enzimas, 1 g de enzima imobilizada foi suspenso em 5 mL de solução tampão de acetato de sódio 50 mM a pH 5, fosfato de sódio 50 mM a pH 7 ou carbonato de sódio 50 mM a pH 9 a temperatura de 55 oC para todos os tampões utilizados. Periodicamente, foram retiradas amostras e a atividade foi medida usando p-NPB. As meias-vidas foram calculadas de acordo com o modelo de Sadana e Henley (FERNANDEZ-LAFUENTE et al., 1993).

Versatilidade do suporte ativado com divinilsulfona para o melhoramento das propriedades de CALB durante sua imobilização

6.3.5.4 Os ensaios de estabilidade na presença de dioxano

Preparações de enzima foram incubadas em 70% dioxano/30% tampão Tris 100 mM a pH 7 e com temperaturas de 25 oC para proceder à sua inativação. Periodicamente, foram retiradas amostras e a atividade foi medida utilizando-se p-NPB como descrito acima. As meia-vidas foram calculadas a partir dos cursos de inativação observados. O dioxano apresentado nas amostras de medição não teve um efeito significativo sobre a atividade da enzima.

6.3.5.5 Hidrólise de mandelato de metila

Para este experimento 200 mg das preparações imobilizadas foram adicionadas à 2 mL de substrato mandelato de metila 50 mM em acetato de sódio 100 mM a pH 5, fosfato de sódio 100 mM a pH 7 ou o carbonato de sódio 100 mM a pH 9 e 25 °C, sob agitação. A conversão foi analisada por RP-HPLC (Spectra Physic SP 100 acoplado com um detector de UV SP SpectraPhysic 8450) usando coluna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 centímetros).

As amostras (20 µL) foram injetadas e eluídas a um fluxo de 1,0 mL/min utilizando acetonitrila/acetato de amônio 10 mM (35%:65%, v/v) a pH 2,8 como fase móvel e detecção por UV a 230 nm. O ácido mandélico tem um tempo de retenção de 2,5 minutos, enquanto o éster tem um tempo de retenção de 10 minutos. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de ácido mandélico por minuto sob as condições descritas acima. A atividade foi determinada em triplicata com uma conversão variando de 20-30%, e os dados são apresentados como valores médios.

6.3.5.6 A hidrólise do fenilacetato de metila

Para este experimento 200 mg das preparações imobilizadas foram adicionados a 2 mL de solução contendo substrato fenilacetato de metila (5 mM) em tampão 100 mM contendo 50% de CH3CN. Os tampões eram de acetato de sódio a pH 5, fosfato de sódio a pH 7 e bicarbonato de sódio a pH 8,5. Todos os experimentos foram realizados a 25 oC sob agitação. A conversão foi analisada por RP-HPLC (Spectra Physic SP 100 acoplado com um detector de UV SP SpectraPhysic 8450) usando coluna Kromasil C18 (15 cm x 0,46

Versatilidade do suporte ativado com divinilsulfona para o melhoramento das propriedades de CALB durante sua imobilização

centímetros). As amostras (20 µL) foram injetadas e eluídas a uma vazão de 1,0 mL/min utilizando uma mistura de acetonitrila: solução aquosa 10 mM de acetato de amónio (35: 65, v/v) e pH 2,8, como fase móvel e a detecção UV era realizada a 230 nm. O ácido fenilacético tem um tempo de retenção de 3 minutos, enquanto o éster fenilacetato de metila tem um tempo de retenção de 12 minutos.

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de ácido fenilacético por minuto sob as condições descritas acima. A atividade foi determinada em triplicata, com um máximo de conversão de 20-30%, e os dados são apresentados como valores médios.

6.3.5.7 A hidrólise do acetato de hexanoato

A atividade enzimática foi determinada através da utilização de hexanoato de etila, onde 200 mg das preparações imobilizadas foram adicionadas a 2 mL de substrato (25 mM) em tampão 50 mM que contém 50% de CH3CN. O tampão foi acetato de sódio 50 mM a pH 5, fosfato de sódio 50 mM a pH 7 e bicarbonato de sódio 50 mM a pH 8,5. Todas as experiências foram realizadas a 25 °C, sob agitação.

A conversão foi analisada por RP-HPLC (Spectra Physic SP 100 acoplado com um detector de UV Spectra Physic SP 8450) usando uma coluna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 centímetros). As amostras (20 µL) foram injetadas e eluída a um fluxo de 1,0 mL/min utilizando / solução de acetonitrilo 10 mM de acetato de amónio aquoso (50:50, v/v) e pH 3,2 como fase móvel e detecção UV foi efetuada a 208 nm .

O ácido hexanóico tem um tempo de retenção de 3,4 minutos, enquanto o éster tem um tempo de retenção de 14,2 minutos. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de ácido hexanóico por minuto sob as condições descritas acima. A atividade foi determinada em triplicata, com um máximo de conversão de 20-30%, e os dados são apresentados como valores médios.

Versatilidade do suporte ativado com divinilsulfona para o melhoramento das propriedades de CALB durante sua imobilização

6.4 Resultados

6.4.1. Imobilização de CALB em agarose ativada com divinilsulfona a diferentes valores de