D´eroulement d’une exp´erience de s´eparation cellulaire

Pr´eparation des diverses solutions

Cellules mod`eles pour la s´eparation cellulaire. Nous avons utilis´e au cours de l’exp´erience des lign´ees cellulaires de lymphocytes B et T. Ces lign´ees nous ont ´et´e fournies par le laboratoire de Claire Hivroz (Institut Curie, UMR144). La lign´ee de lymphocytes B se nomme Raji (ATCC, CCL-86). La lign´ee de Lymphocytes T se nomme Jurkat Clone E6-1 (ATCC, TIB-152).

Si le lecteur n’est pas familier avec les techniques de culture cellulaire il peut se reporter `a l’Annexe C o`u nous d´etaillons et expliquons toute la m´ethode ; dans la suite nous ne donnons qu’un protocole abr´eg´e suffisant pour les initi´es. Les cellules sont cultiv´ees dans un milieu RPMI 1640/ Glutamax (Invitrogen) compl´et´e avec du s´erum de veau `a 10 % v/v (FBS, Invitrogen) plus un m´elange P´enicilinne (100 U/mL)/Streptomycine (100 µg/mL) (Invitrogen) dans un incubateur maintenu `a 37 °C et `a 5 % de CO2. Les cellules sont initialement mises `a une concentration de 300 000 cellules/ml laiss´ees en culture jusqu’`a 1,2 millions de cellules par mL, concentration de saturation. Les passages se font tous les deux jours. Le pH est suivi visuellement grˆace au rouge de ph´enol pr´esent dans la solution de RPMI. Les cellules sont inspect´ees visuellement `a chaque passage et la mort cellulaire est r´eguli`erement suivie par Bleu de Trypan.

L’expression des marqueurs de membrane est suivie par cytom´etrie en flux (FACSCaliburTM, BD Biosciences). Les antig`enes de surface CD3 et CD19 sont marqu´es avec des anticorps monoclonaux respectivement anti-CD3 (clone S4.1, In-vitrogen) et anti-CD19 (clone HIB19, BD Biosciences). Ces anticorps sont coupl´es `a un fluorophore Alexa Fluor 488 (λexc = 488 nm, λem = 521 nm). Les cellules sont prises du milieu de culture et centrifug´ees 4 minutes `a 1200 rpm. Les cellules sont resuspendues dans un tampon PBS (Invitrogen) `a pH = 7,4. L’anticorps est incub´e 30 minutes `a temp´erature ambiante sous agitation. Les cellules sont lav´ees 2 fois et resuspendues dans le PBS. Un contrˆole suppl´ementaire peut consister `a regarder les cellules directement sur un microscope par ´epifluorescence. A la figure 2.15, nous v´erifions le ph´enotype associ´e au lymphocytes T : CD3+, CD19-. Nous constatons

cependant qu’une faible fraction (environ 20 % de lymphocytes T) n’exprime pas le CD3. Par ailleurs, le ph´enotype associ´e au lymphocytes B est CD3-, CD19+ ce qui est tr`es clair sur les donn´ees de cytom´etrie (Fig. 2.15). La population positive en CD19 est tr`es homog`ene.

Billes magn´etiques pour la s´eparation cellulaire. Nous avons utilis´e pour la s´eparation deux types de billes. Pour sp´ecifiquement isoler les lymphocytes T, nous utiliserons des billes magn´etiques Dynal 4,5 µm fonctionnalis´ees avec des anticorps anti-CD3. Nous utiliserons des billes fonctionalis´ees avec des anticorps anti-CD19 pour capturer les lymphocytes B. Les billes sont rinc´ees une fois sur un immobilisa-teur magn´etique et resuspendues dans un tampon PBS-BSA 0,2 % concentr´e 3 fois. Afin d’enlever des agr´egats, les billes peuvent ˆetre vortex´ees quelques instants. D´eroulement d’une exp´erience de s´eparation cellulaire.

Pr´eparation de la puce microfluidique. Les puces microfluidiques sont conserv´ees dans des boˆıtes de Petri afin de les prot´eger de la poussi`ere. Avant une ex-p´erience, nous injectons dans la puce pendant 2 heures un polym`ere, le PDMA-AGE (Coloym`ere de dim´ethylacrylamide et d’´ether allyl glycidyl [Chiari et al., 2000]) qui va s’adsorber `a la surface des canaux et ainsi ´eviter l’adsorption non sp´ecifique des cellules. Ensuite, nous injectons une solution de PBS-BSA 1 % w/v pour adsorber ´egalement de la BSA qui prot`ege ´egalement de l’adsorption non-sp´ecifique.

Les canaux de contrˆole des valves sont remplis d’eau que nous injectons en ap-pliquant une pression de 1 bar sur les valves. Des adaptateurs sont mis dans la puce et remplis de PBS-BSA 0,2 %. Tous les r´eservoirs sont remplis `a niveau environ ´egal de liquide pour ´eviter des diff´erences de pression entre r´eservoirs. Les liquides sont inject´es grˆace `a des cˆones longs, g´en´eralement utilis´es pour remplir les gels d’´electrophor`ese ; nous ´evitons ainsi d’introduire des bulles dans la puce. La puce, ainsi pr´epar´ee, est plac´ee sur le microscope dans la bobine magn´etique. Avant toute exp´erience, nous v´erifions l’absence de bulles et de poussi`eres dans le canal. Nous pouvons alors commencer `a manipuler.

Injection des billes magn´etiques et des cellules. On utilise tout au long de l’exp´erience un objectif de grossissement × 10 pour avoir un large champ de vision. Dans un premier temps on injecte les billes magn´etiques et, dans une second temps on injecte les cellules. Les diff´erentes ´etapes des op´erations sont d´ecrites `a la figure 2.16. Dans le puits n°1 on injecte 6 µL de billes magn´etiques. On applique une surpression en 1 et 2 pour amener les billes dans le reservoir n°4 qui fait office de poubelle. Visuellement on s’assure que les billes ont une concentration homog`ene. La valve du r´eservoir n°3 reste ferm´ee. En proc´edant ainsi, on ´evite que la croix ne soit envahie de billes magn´etiques. On applique le champ magn´etique. En diminuant la pression

Figure2.15 – Caract´erisation ph´enotypiques des cellules Raji et Jurkat. En abs-cisse, on trouve le FS-C, Forward Scatter. En ordonn´ee on trouve l’intensit´e de fluorescence dans le canal correspondant `a AlexaFluor 488 en ´echelle logarithmique.

P1 les colonnes interstitielles sont ramen´ees vers le r´eservoir n°1. Quand toutes les colonnes interstitielles sont ´elimin´ees, on diminue progressivement les pressions P1

et P2 jusqu’`a les ramener `a 0. Les valves conduisant aux reservoirs 2 et 4 sont ferm´ees. La valve n°3 ferm´ee, on injecte dans le r´eservoir n°3 20 µL de cellules `a une concentration de 2.106

cellules par millilitres bien au fond du r´eservoir. On ouvre la valve n°3 en s’assurant que les colonnes ne soient pas endommag´ees `a cause d’une trop grande diff´erence de pression entre les r´eservoirs n°1 et n°3. Ceci peut arriver accidentellement. Les cellules sont alors introduites. Visuellement on s’assure que la vitesse des cellules ne casse pas les colonnes magn´etiques. On arrˆete le flux en diminuant la pression P3. On ferme la valve du r´eservoir n°3. On ouvre la valve du r´eservoir n°2 pour ´eliminer les cellules r´esiduelles. Par le r´eservoir n°2, nous pourrons injecter toutes les solutions n´ecessaires pour marquer les cellules ou encore introduire le milieu de culture. Grˆace aux valves pneumatiques, toutes les op´erations d’injection successives peuvent ˆetre r´ealis´ees en isolant les colonnes de billes magn´etiques.