Développement de lignées cellulaires de Pteropus giganteus . 117

L’espèce Pteropus giganteus a été spécifiquement choisie pour ses liens potentiels avec les épidémies de NiV (Yadav et al. 2012 ; Hahn et al. 2014). Les échantillons du zoo de Peaugres (en France) consistaient en des échantillons de membrane alaire et de testicule, et ceux du zoo de Vienne (en Autriche) en des échantillons de membrane alaire et de poumon.

Figure 1 : Photo des lignées cellulaires obtenues à partir des échantillons provenant du zoo de Vienne. A : Culture

primaire de cellules issues de membrane alaire. B : Culture primaire de cellules issues de poumons (les cultures de cellules primaires de poumon ont été réalisée par Noémie Aurine). C : Culture de cellules immortalisées (PATGV1.12) avec hTERT et LargeT issues de la culture primaire issue de membrane alaire.

Les prélèvements effectués ont été fractionnés et mis en culture dans différents milieux. Des cellules primaires ont commencé à coloniser les boîtes de pétri, à partir des différents échantillons (membrane alaire, testicule et poumon), après 1 à 2 semaines de culture. Les cellules obtenues étaient de type fibroblastique (Figures 1A et 1B). Elles ont été congelées pour la constitution de stock. L’immortalisation des cellules primaires issues de la membrane alaire a été confirmée par la détection des inserts hTERT et LargeT par PCR. Après leur immortalisation, ces cellules ont été nommées (PATGV1) et clonées. A noter le changement de morphologie apparu dans ces cellules après immortalisation (Figure 1A (avant) et 1C (après)). Les clones ont ensuite été sélectionnés en fonction de leur temps de doublement et leur transfectabilité avec les kits commerciaux disponibles dans notre laboratoire. Le clone PATGV1.12 a été retenu sur ces deux critères, même si le taux de transfection de ces cellules restait faible (environ 10% avec JetPrime).

La traçabilité des individus en zoo n’étant pas disponible, les différentes espèces de

Pteropus étant difficiles à distinguer sur des critères morphologiques et compte-tenu de la

possibilité d’accouplement d’individus de différentes espèces dans les volières, les espèces des chauves-souris prélevées ont été déterminées génétiquement. Pour ce faire, les séquences d’ADN mitochondriale D-loop ont été séquencées à partir des différentes cultures cellulaires obtenues. La séquence de D-loop est largement utilisée chez de nombreux animaux, comme marqueur des variations inter-espèces et pour la compréhension de l’évolution des systèmes (Sziszkosz et al. 2016 ; Chen et al. 2016 ; Sultana et al. 2016). Les

118 séquences obtenues ont été alignées avec des séquences disponibles sur internet pour d’autres espèces de Pteropus et un arbre phylogénétique a été construit par la méthode du neighbor-joining (Figure 2). Alors que les échantillons issus du zoo de Vienne sont dans le taxon de Pteropus giganteus, celui issu du zoo de Peaugres se situe entre le taxon de Pteropus

giganteus et de Pteropus vampyrus. Le vétérinaire du zoo de Peaugres avait en effet suggéré

que ces individus pouvaient être issus de croisements entre Pteropus giganteus et Pteropus

lylei (aucune séquence de D-loop de Pteropus lylei n’est disponible sur internet). Les cellules

issues des échantillons du zoo de Peaugres ont été conservées, mais écartées des manipulations expérimentales en attendant une meilleure caractérisation.

Figure 2 : Arbre phylogénétique basé sur la séquence d’ADN mitochondriale D-loop obtenu par la méthode du

neighbor-joining. Abréviations : Pta = Pteropus alecto, Ptv = Pteropus vampyrus, Ptg= Pteropus giganteus, Eqc = Equus caballus. Les séquences correspondantes de l’ADN des cellules primaires issues du zoo de Peaugres (DNAPeaugres) et du zoo de Vienne (DNAVienne), ainsi que l’ADN issu des cellules immortalisées (DNAPATGV1) ont été également intégrées dans cet arbre.

2. Cinétique d’infection des cellules de chauves-souris par NiV

Les cellules immortalisées PATGV1.12 (Figure 1C) et les cellules primaires de poumon (Figure 1B) ont été infectées avec les deux souches de NiV, Malaisie (NiV-M) et Bangladesh (NiV-B). D’une façon générale, l’infection par NiV a entraîné peu d’effets cytopathiques dans ces cellules, comparés aux effets cytopathiques couramment observés dans des cellules humaines (Borisevich et al. 2017).

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Figure 3 : Cinétique d’infection des cellules de chauve-souris immortalisées PATGV12 et de cellules primaires de

poumon par les virus NiV-M et NiV-B par qPCR (l’ensemble des qPCR présentées dans cette figure a été réalisé par Noémie Aurine). A : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN génomique de NIV-M et NiV-B dans des cellules PATGV1.12 infectées à MOI 5. B : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN de la nucléoprotéine de NIV-M et NiV-B dans des cellules PATGV1.12 infectées à MOI 5. C : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN génomique de NIV-M et NiV-B dans des cellules primaires de poumon infectées à MOI 3. D : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN de la nucléoprotéine de NIV-M et NiV-B dans des cellules primaires de poumon infectées à MOI 3. E : Evolution au cours du temps de la quantité d’ARN génomique de NIV-M et NiV-B dans le surnageant (SN) de cellules primaires de poumon infectées à NIV-MOI 3. Pour C et D, un des puits du duplicat a été utilisé pour réaliser une extraction protéique (données non présentées), les résultats à chaque temps sont donc des simplicats.

120 Dans les cellules PATGV1.12, le nombre de copies d’ARN génomiques viraux augmente d’environ un log10 dans les premières 24h, atteint un maximum environ 50h après infection et décroit doucement lors des 150h suivantes (Figure 3A). Les deux souches présentent un profil similaire, bien que moins de copies d’ARN génomique de NiV-B soient détectées à T = 0h. Dans ces mêmes cellules, le nombre de copies d’ARN de la N de NiV-M augmente d’environ 2 log10 dans les premières 24h, atteint un maximum environ 50h après infection et décroit doucement lors des 150h suivantes (Figure 3B). Alors que le nombre de copies d’ARN de la N est relativement similaire entre NiV-M et NiV-B à T = 0h, l’augmentation dans les 1ères 24h est plus limitée pour NiV-B (moins d’un log10).

Dans les cellules primaires de poumons, le nombre de copies d’ARN génomiques viraux augmente progressivement pour atteindre 150h après infection une augmentation d’environ 2 log10 pour NiV-M et d’un log10 pour NiV-B, par rapport au nombre de copie à T = 0h (Figure

3C). La détection du nombre de copies d’ARN génomiques viraux dans le surnageant de ces

cellules présente un profil similaire (Figure 3E). Le nombre de copies d’ARN de la N de NiV-M augmente d’environ 3 log10 dans les premières 50h et reste stable lors des 125h suivantes, alors que le nombre de copies d’ARN de la N de NiV-B augmente d’environ 2 log10 dans les premières 24h et reste stable lors des 150h suivantes (Figure 3D).

3. Compatibilité des anticorps commerciaux pour l’étude des voies de