Développement de l'analyse non ciblé dans les tissus de la moule

Dans cette thèse doctorale, une approche non ciblée basée sur la génération de profils chimiques obtenus par LC-HRMS a été appliqué dans des extraits de moules méditerranéennes (M. galloprovincialis) pour caractériser les métabolites connus (déjà renseignés dans la littérature chez l'homme et chez la moule) et rechercher des métabolites non connus de l'antidépresseur venlafaxine. Afin d'augmenter la probabilité de détection des métabolites des phases I et phases II (connus et non connus) dans la moule, une méthode de traitement tissulaire a été développée en utilisant les propriétés physico-chimiques de ces composés, notamment la charge sur le groupe fonctionnel amine. Cette approche ciblée a été validée avec 7 métabolites connus de la venlafaxine chez l'homme et elle a été décrite en détail à la section 2.2. Le développement de l'analyse non ciblée comprend trois étapes: le design expérimental, l'acquisition des données et la métodologie de recherche des métabolites. Ces étapes sont décrites ci-dessous.

3.2.1 Design expérimental

Le design expérimental appliqué à l'exposition de moules à la venlafaxine en conditions contrôlées a été réalisé dans le but de nous renseigner sur les métabolites (connus et non connus) qui pourraient être produits chez la moule lorsqu'elles sont exposées à une concentration semblable à celle rapportée pour la VEN dans les eaux de surfaces.

Au laboratoire, les moules (M. galloprovincialis), fournies par un conchyliculteur de Bouzigues (34, France), ont été nettoyées et la taille des coquilles a été mesurée (entre 6,0 et 7,2 cm). Deux groupes d'aquariums (5 aquariums par groupe; 2 L d'eau de mer/ 5 moules/aquarium) ont été préparés: un groupe contrôle solvant (le véhicule pour la VEN étant le méthanol, SC) et un groupe exposé (Ex) à 10 ng/L (concentration nominale). Après une période d'acclimatation de 7 jours, chaque groupe a été exposé durant 3 jours et 7 jours avant dissection. Pendant les périodes d'acclimatation et d'exposition, l'eau de mer a été renouvelée tous les jours (renouvellement statique) dans les deux groupes (control et exposé), la température ambiante a été régulée à 15 ± 2 °C et les moules ont été nourries avec une suspension d'algue Tetraselmis suecica (Greensea, Mèze, 34, France) à une concentration de 10,000 cell/mL.

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3.2.2 L'acquisition des données

La méthode ciblée décrite dans la section 2 pour déterminer la venlafaxine et ses métabolites dans les tissus mous des moules a été appliquée dans les échantillons de cette étude. Après le processus d'extraction/purification des tissus, les échantillons ont été analysés par chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse hybride Q-Orbitrap (Q-Exactive, Thermo Sicentific) qui permet d'allier sélectivité et résolution. L'utilisation de Q-Orbitrap en mode Full MS à double polarité (switch) a permis d'obtenir la masse exacte (<5 ppm) et la formule brute de chaque molécule d'intérêt présent dans les échantillons tandis que l'utilisation en mode MS² (fragmentation) a permis de sélectionner et fragmenter les molécules d'intérêt afin d'obtenir leurs spectres de fragmentation et des informations sur leur structure. En vue de réaliser deux événements au cours de la même acquisition (exemple: balayage complet à double polarité (positive et négative) ou balayage complet à polarité positive et fragmentation), le pouvoir résolutif a été fixé à 35000. Le choix de faire les acquisitions à double polarité au cours de la même analyse a été réalisée afin: 1) d'augmenter les possibilités de trouver des métabolites en utilisant les deux types d'ionisation et 2) d'éliminer le décalage potentiel du temps de rétention des signaux d'intérêt entre les deux modes d'ionisation.

3.2.3 Stratégie de recherche de métabolites

Après l'acquisition des données, une comparaison des profils métaboliques obtenues pour chacun des deux groupes (SC et Ex) a été réalisée afin de mettre en évidence des signaux présents dans les moules exposées et absents dans les moules non exposées à la VEN, donc susceptibles de correspondre à la VEN ou à ses produits de métabolisation. Pour cette première étape, nous avons décidé d'utiliser le logiciel R avec le script XCMS. Ce script identifie dans un premier temps l'ensemble des pics chromatographiques présents dans chaque échantillon soumis au retraitement. Il regroupe ensuite les pics chromatographiques possédant un rapport masse sur charge (m/z) et un temps de rétention similaire entre les différents échantillons. Enfin, le script recherche les données manquantes éventuelles dans un ou plusieurs échantillons de la série. Les signaux ainsi détectés sont réunis dans un fichier unique permettant une meilleure vue d'ensemble des informations acquises. Des indicateurs statistiques tels que le fold change (calculé comme le rapport entre l'intensité moyenne du signal dans les échantillons exposés et l'intensité moyenne du signal dans les échantillons contrôle) et la valeur p-value sont également montrés pour chacun des signaux dans ce fichier. Seuls les signaux ayant un fold change supérieur à 10 en mode d'ionisation négative ou positive ont été conservés et traités pour élucider leurs structures. De plus, les chromatogrammes ioniques extraits (EIC en anglais) ont été vérifiés pour tous les signaux potentiels associés aux métabolites afin de confirmer l'absence de tout signal dans les témoins. Afin d'illustrer, nous avons pris comme exemple deux chromatogrammes ioniques extraits obtenus en mode d'ionisation positive pour les signaux suspects avec les valeurs moyennes m/z expérimentales de A) 260,2008 et B) 264,1957 (figure 18). Les deux signaux se trouvent uniquement dans les échantillons exposés (Ex) et sont absents dans les échantillons contrôle (SC).

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Dans une deuxième étape, nous avons verifié le temps de rétention et la forme de pic des signaux suspects en utilisant le "layout' du logiciel ThermoXcalibur Qual Browser (Xcalibur 3.0, Thermo Fisher Scientific Inc.) pour déterminer si les signaux potentiels sont associés à la molécule mère VEN (exemple dimère ou isotopes de cette molécule) ou sont des métabolites potentiels. Afin d'illustrer, nous avons pris comme exemple le signal de la VEN et les deux signaux potentiels montrés précédement dans la figure 18. En comparant le pic de la VEN avec le premier signal suspect (A), le temps de rétention et la forme des pics sont très similaires, ce qui indique que ces signaux peuvent être associés (figure 19). Au contraire, en comparant la VEN et le deuxième signal suspect (B), les deux paramètres évalués (temps de rétention et forme du pic) ne sont pas très semblables. Le signal B peut potentiellement être un métabolite.

c

Ex

SC

Ex

SC

A B

Figure 18. Exemples d'EIC de deux signaux potentiels à être des métabolites

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Une troisième étape a consisté à déterminer la différence de masse moyenne expérimentale entre les signaux suspects et le signal VEN afin d'identifier le fragment correspondant à l'aide du logiciel ThermoXcalibur Qual Browser en utilisant les outils de composition élémentaire et de simulation isotopique. Avec les informations précédentes, nous avons pu proposer des structures candidats pour les signaux potentiels. Un calcul final a été effectué, la différence entre la masse théorique et la masse expérimentale de chaque structure candidat proposée. La valeur de la différence doit être inférieure à 5 mmu pour qu'il y ait coïncidence et à ce moment-là, s'il existe une coïncidence, nous avons appliqué l'analyse ciblée pour confirmer et quantifier le métabolite. Cette strategie de recherche de métabolites a été appliquée à tous les signaux suspects.

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