Détermination de la géométrie des doubles liaisons par RMN à haut champ 105

Les analyses RMN à très haut champ ont été réalisées par M. Moreno Lelli au Centre de RMN à Très Hauts Champs de l’Institut des Sciences Analytiques UMR 5280 CNRS/Université Lyon 1/ENS-Lyon en vue de déterminer la configuration cis (Z) ou trans (E) des doubles liaisons des triènes conjugués présents dans les 4 isomères 9,16-HOTE. Leurs structures ont été vérifiées en examinant l’attribution des protons liés aux carbones sp² dans les doubles liaisons C=C. La configuration Z ou E des différentes doubles liaisons a été déterminée en mesurant les constantes de couplage sachant que les valeurs sont de l’ordre de ~ 17 Hz pour la configuration E et d’environ 10 Hz pour la configuration Z (Silverstein RM & Webster FX, 1998).

De plus, les spectres RMN des acides 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque élués respectivement à 33,2 min et 33,5 min (voir Fig. 23B), qui ne diffèrent que par l'inversion de la configuration stéréochimique du centre chiral porté par le carbone16, doivent présenter des différences mineures dans les déplacements chimiques et dans les constantes de couplage J notamment dans la région des triènes.

Sur ces bases, l’inspection des spectres RMN 1D, et en particulier de la région de résonance triène (4-7 ppm) (Fig. 28 et la Fig. 29) permet de distinguer rapidement parmi l'ensemble des molécules en fonction de la configuration de leur triène (par exemple différencier les composés E,E,E élués à 32,1 min et 32,6 min des composés

été mesurées par l'analyse des spectres 2D de résolution. De cette façon, nous avons trouvé que la constance de couplage J ¹H-¹H-³ entre les protons situés des carbones 10-11 et 14-15 qui était d’environ 15 Hz dans tous les cas examinés, démontrant le caractère E de ces deux doubles liaisons.

La mesure de la constante de couplage J_12,13 a été plus difficile à obtenir en raison de la quasi-équivalence des déplacements chimiques, des effets de second ordre entre H12 et H₁₃ et de la superposition des signaux des carbones. Pour simplifier le modèle, nous avons observé les résonances des protons des carbones 12 et 13 dans les spectres 1D de l’acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque élué à 33,5 min, (Fig. 23B) en effectuant un découplage sélectif des protons des carbones 11 et 14. Cette importante simplification du modèle multiplet a permis de mettre en évidence un couplage ³J12-13 d’environ 10 Hz qui est typique d’une configuration Z. La même approche n’a pas pu être réalisée dans le cas des molécules E,E,E en raison du chevauchement fort entre les protons des carbones 11,12,13,14 qui ont des déplacements chimiques très similaires. Néanmoins, puisque la détermination de la configuration des doubles liaisons des triènes des molécules E,Z,E a été clairement établie ci-dessus, nous pouvons attribuer avec certitude par l'exclusion la configuration des doubles liaisons des triènes des molécules E,E,E sur la base des différences importante entre les spectres RMN des molécules E,E,E et E,Z,E.

Figure 28: Techniques de RMN appliquées à l’acide 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque et l’acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque pour la détermination de la configuration de la double liaison

Spectres 1D et J-accouplements pour l’acide 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque (A) et l’acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque (B) l’Assignation du résonance et les constantes de couplages J ont déterminées à partir de l'analyse d'un COSY DQF et 2D des spectres de résolution (données non présentées). Les spectres ont été acquis avec 8 scans et 2s de délai de recyclage, le temps d'acquisition est de 1,8 s.

Figure 29: Techniques de RMN appliquées à l’acide 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et l’acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque pour la détermination de la configuration de la double liaison

Spectres 1D et J-accouplements pour l’acide 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z, 14E-triénoïque(A) et l’acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque (B) l’Assignation des résonances et les constantes de couplages J ont déterminées à partir de l'analyse d'un COSY DQF et spectres 2D de résolution (données non présentées). Les spectres ont acquis avec 8 scans et 2s de délai de recyclage, le temps d'acquisition est de 1,8 s.

Cette étude RMN permet de conclure que les géométries des doubles liaisons conjuguées des di-hydroxylés sont 10E,12E,14E, 10E,12E,14E, 10E,12Z,14E et 10E,12Z,14E pour les différents isomères élués respectivement à 32,1 min, 32,6 min, 33,2 min et 33,5 min, voir Fig. 23B.

Les métabolites di-hydroxylés formés à partir de l’ALA sont les acides 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque.

I.5 Métabolisme de l'ALA par la 15-LOX-2 recombinante humaine

Cette expérience a été réalisée afin de vérifier si la 15-LOX-2 humaine recombinante était capable de synthétiser ces métabolites. A cet effet, l’ALA, le 9(S)-HOTE et le 9(±)-9(S)-HOTE ont été incubés séparément avec cette enzyme. Nous avons trouvé que la 15-LOX-2 recombinante humaine pouvait effectivement convertir l’ALA en 13-HOTE, comme nous l’avons déjà montré précédemment avec la sLOX. Cependant, la 15-liopoxygénase recombinante humaine semble moins efficace que la sLOX pour métaboliser l’ALA en acide gras di-hydroxylés et les métabolites principaux observés (Fig. 30B) étaient les isomères 9,16-diHOTEs avec une configuration E,E,E, les isomères E,Z,E étant minoritaires. Par contre et sans doute plus pertinent sur le plan biologique, le dérivé mono-hydroxylé 9(S)-HOTE est très bien métabolisés en 9(S),16(S)-diHOTE (voir Fig. 30A). Le 9(R)-HOTE qui est produit dans des situations inflammatoires via la COX-2 via un processus de cyclisation avorté, en particulier après un traitement par l'aspirine (Schneider C & Brash AR, 2000), pourrait aussi être métabolisé en 9(R),16(S)-diHOTE par la 15-LOX-2 recombinante humaine.

Figure 30: Exemple de chromatogrammes (HPLC) montrant les différents métabolites synthétisés à partir de 9(S)-HOTE et l’ALA via la 15-LOX humaine

recombinante

Les conditions opératoires sont décrites au paragraphe I.8 dans « Matériels et Méthodes ». (A) 9(S),16(S)-E,Z,E-diHOTE synthétisé à partir de 9(S)-HOTE par la 15-LOX humaine recombinante; (B) all trans-9(R),16(S)-diHOTE et 9(S),16(S)-diHOTE synthétisé à partir de l’ALA par la 15-LOX humaine recombinante.

I.6 Conclusion de l’étude du métabolisme oxygéné de l’ALA

Tous les résultats (chromatographiques, GC-MS, RMN) montrent que les quatre composés di-hydroxylés synthétisés à partir de l’ALA via la sLOX sont les acides 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque, et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque.