Chapitre 1 : L’électrophorèse capillaire et l’utilisation de la double détection UV LEDIF pour
2.3 Détermination de la constante de dissociation du complexe T29 Thrombine
Ce travail a été réalisé par de nombreux auteurs. 2.3.1 Par électrophorèse capillaire
On rappelle que l’équilibre d’un aptamère avec sa cible est régit selon l’équation suivante : Aptamère + cible
𝑘𝑜𝑛 ⇌
𝑘𝑜𝑓𝑓 [complexe Aptamère.cible] où 𝐾𝐷
= 𝑘𝑜𝑓𝑓 𝑘𝑜𝑛
Nous avons réalisé une gamme étalon de thrombine allant de 0 à 25nM et en utilisant pour l’aptamère T29, une concentration constante de 25 nM. Nous avons choisi cette concentration en nous basant sur les travaux de S. Krylov, qui préconise lorsque la valeur de KD n’est pas connue précisément, de maintenir la valeur de concentration de l’aptamère la plus faible possible afin que les aires mesurées du complexe [T29.thrombine] soient les plus fiables. Le capillaire utilisé était un capillaire de silice, de longueur totale L = 90 cm (longueur effective l = 19 cm). Le tampon de migration utilisé était le tampon Na2HPO4 à une concentration de 50 mM, pH= 8.2. Le tampon de dilution des échantillons était un tampon composé de Na2HPO4 à 50 mM + NaCl 100 mM + MgCl2 1 mM. Le conditionnement du capillaire était le suivant : Lavage 3 min NaOH 1M / 3 min eau / 3 min tampon de migration. Injection : 50 mBar, 30 secondes. Séparation : + 15 kV, + pression 5 mBar. A partir d’une solution mère de T29 à 100 µM, ce dernier a été dilué à 25 nM. La thrombine a été diluée à partir d’une solution mère à 20 µM. Pour réaliser l’interaction avec la thrombine, il faut chauffer l’échantillon d’aptamère à 95°C pendant 5 min, puis le laisser revenir à température ambiante. Ensuite, on incube 10 µL
Figure 2-1 : Analyse de l'aptamère T29 100 nM (électrophérogramme en rouge) et du complexe T29 50 nM + thrombine 100 nM (électrophérogramme bleu). L'aptamère a un temps de migration de 18.1 min et le complexe migre à t= 11.7 min. Capillaire en silice - diamètre : 50 µm. Longueur totale L= 90 cm (longueur effective l= 21 cm). Tm= 18 min. Tampon de séparation : Phosphate de sodium dibasique 50 mM pH=8.2. Injection : 50 mBAR, 30 s. Séparation : + 20 kV, + pression 5 mBAR
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de thrombine avec 10 µL d’aptamère et on injecte le mélange par électrophorèse capillaire (Figure 2-10).
Figure 2--10: Détermination du temps de migration de l'aptamère T29 25 nM t= 8.5 min (egram noir) pour la mesure de KD
par détection LIF. L’électrophérogramme bleu montre l’interaction entre l’aptamère à 25 nM et la thrombine à 150 nM.
On observe une diminution du pic de l’aptamère libre et l’apparition d’un pic à t= 4 min correspondant au complexe [T29. Thrombine].
Pour déterminer la constante de dissociation KD, nous avons mesuré l’aire du pic correspondant au complexe pour chaque concentration de thrombine (Figure 2-13). La courbe Aire du pic de complexe = f [thrombine] a ensuite été tracée (Figure II-12).
Figure 2-2 : Aire du pic de complexe = f [thrombine] (nM)
[Thrombine] (nM) Aire du pic [T29.thrombine] Aire du pic [T29.thrombine] Aire du pic [T29.thrombine] 0 0 0 0 1.5 0.4 0.4 0.4 3 2.9 2.5 2.3 6 2.2 2.3 2.6 12.5 2.6 2.6 2.6 25 3 3.2 3
Figure II-3 : Valeur des aires obtenues pour le complexe [T29. Thrombine] en réalisant un complexe de T29 à 25 nM + différentes concentrations de thrombine à 0 - 1,5 - 3 - 6 - 12,5 et 25 nM. L'aire de chaque pic de complexe est déterminée grâce au logiciel Chemstation.
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Ainsi la valeur obtenue pour la constante de dissociation est KD = 2.62 +/- 0.83nM. Cette valeur est dans le champ des valeurs trouvées dans la littérature qui varient entre 0.5nM et 200nM selon la méthode utilisée.
2.3.2 Par filter binding
La valeur de KD a également été déterminée par filter binding afin de pouvoir comparer les valeurs obtenues par les deux méthodes (Figure 2-14).
Le tampon utilisé était composé de : Tris HCl 50 mM, pH= 7.5 + NaCl 100 mM + MgCl2 1 mM. Le tampon a ensuite été filtré avec un filtre de diamètre 0.2 µm. Pour réaliser l’interaction entre l’aptamère et la thrombine, l’aptamère marqué au P32 a été chauffé à 95°C pendant 5 minutes, puis la température est abaissée jusqu’à température ambiante pendant 40 min. Ce mélange est ensuite passé à travers un filtre de nitrocellulose. L’ADN libre passe à travers le filtre de nitrocellulose et sera retenu par le filtre de nylon (Figure 2-15). Le complexe aptamère/ thrombine sera retenu à la surface du filtre de nitrocellulose.
Figure 2-4 : Schéma de principe du filter binding avec le filtre en nitrocellulose qui retient la thrombine et le filtre en nylon qui permet de piéger tout l’ADN qui n’est pas retenu par la membrane.
Pour quantifier le nombre de molécules liées à la thrombine, le mélange est ensuite lavé, séché et les filtres sont exposés au phosphoImager (Storm 840) (Figure II-15).
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Figure 2-5 : Analyse par filter binding de l'aptamère T29. Le filtre en nitrocellulose va permettre de retenir les protéines, tandis que les molécules d’ADN non liées vont passer à travers la nitrocellulose et seront retenus sur le filtre de nylon. Un lavage est ensuite fait avec une solution de KOH afin d’éliminer les molécules d’ADN liées à la cible qui auraient pu rester sur la membrane de nitrocellulose.
La valeur de la constante de dissociation obtenue est de 100nM. 2.3.3 Conclusion
Les valeurs obtenues par ces deux méthodes sont très différentes, bien qu’elles soient obtenues avec la même thrombine. L’analyse par électrophorèse capillaire s’effectue en solution donc la surface de liaison de l’aptamère T29 à la cible est maximale contrairement à la technique de filter binding ou l’on fixe l’aptamère sur une surface. On peut donc supposer que ce paramètre peut avoir une influence sur l’interaction entre la thrombine et le T29. Le point important à noter est que les compositions de chaque tampon sont aussi différentes : tampon sodium de phosphate pour l’électrophorèse capillaire et tampon Tris HCl pour le filter binding mais chaque tampon a une concentration de 50 mM, avec un pH= 8.2. On peut supposer que l’utilisation du Tris HCl par rapport au tampon sodium de phosphate augmente la concentration en sels et peut favoriser une interaction défavorable entre la thrombine et l’aptamère T29 et donc une valeur de la constante de dissociation plus élevée.
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