Détermination de la composition chimique du gel d’Aloe vera

La composition chimique du gel d’AV a été déterminée selon des méthodes biochimiques standardisées (AOAC, 1990), au sein du laboratoire physiologie physiopathologie et biochimie de la nutrition et du laboratoire de Produits Naturels.

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L’azote total est déterminé par la méthode Kjeldahl après minéralisation de la matière organique. La teneur en protéines brutes du gel est obtenue en multipliant la valeur obtenue de la teneur en azote par le facteur 6,25. Les teneurs en fibres totales sont déterminées par hydrolyse acide suivie de l’hydrolyse alcaline des résidus insolubles. Les lipides totaux sont estimés après extraction par la méthode Soxhlet. Les cendres totales (résidu de composés minéraux) sont déterminées après l’incinération du gel dans un four ventilé à 550 °C. Les teneurs totales en glucides sont estimées par différence. Les teneurs en polyphénols totaux sont déterminées par méthode colorimétrique utilisant le réactif Folin-Ciocalteu (FC) avec une calibration utilisant l’acide gallique (AG). Les résultats sont exprimés en mg AG.100 g–1 gel sec. Les teneurs en vitamine C sont déterminées en utilisant le 2, 6- dichloro-phenol-indophenol selon la méthode décrite par l’association des chimistes (AOVC, 1996). Les teneurs en β-carotène sont analysées par méthode spectrophotométrique après extraction par l’acétone. L’absorbance des extraits est mesurée à 450 nm et les teneurs en β-carotène sont déterminées en utilisant le coefficient d’extinction molaire E = 2590 à 450nm (Ball, 1988). Toutes les mesures sont réalisées en triple. La composition du gel est donnée dans le Tableau 3.

Pour extraire les principes actifs du gel, une macération est réalisée en mélangeant 10 g du gel dans 100 ml du mélange méthanol-eau (7:3) pendant 24 heures (Harborne, 1998). Le mélange est par la suite filtré puis concentrée dans un évaporateur rotatif. Le résidu obtenu est solubilisé dans le méthanol pour obtenir l'extrait brut méthanolique. Cet extrait méthanolique est conservé à -4°C. Le screening phytochimique est basé sur un ensemble d’analyses physicochimiques qualitatives sur l’extrait méthanolique. Les tests ont porté sur la recherche des principaux groupes chimiques (alcaloïdes, tanins, flavonoïdes, saponines, coumarines, stérols et triterpènes, composés réducteurs…) par des réactions en tubes, en utilisant les procédures standards telles que décrites par Trease et Evans (1989) et Harborne (1998).

* Les alcaloïdes: Les tests sont réalisés par des réactions de précipitation avec les réactifs de Mayer et de Wagner. Après ajout de 5 gouttes de réactif de Mayer et de réactif de Wagner à 1 ml de l’extrait, l’apparition d’un précipité blanc, brun et orange, respectivement, révèle la présence d´alcaloïdes.

* Les tanins: L’addition à 5 ml d’extrait d’une solution aqueuse de FeCl3 à 1 % révèle la présence de tanins lors de l’apparition d’une coloration verdâtre ou bleu-noirâtre.

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* Les Flavonoïdes : L’addition d’un ml d´alcool iso amylique, de quelques copeaux de magnésium et de quelques gouttes d´acides chlorhydrique (HCl) à 5 ml d’extrait indique la présence des flavonoïdes en cas de l´apparition d´une coloration rose ou rouge.

* Les saponines: Indice de mousse: Dans une série de 10 tubes à essai numérotés, 1, 2, 3…,10ml de l’extrait sont introduits respectivement, le volume est ajusté à 10 ml avec de l’eau distillée. Après agitation des tubes pendant 15 secondes et incubation pendant 15 min, la hauteur de la mousse produite dans chaque tube est mesurée. L´indice de mousse (I) est calculée par la formule suivante : I = 1000 /N. N est le numéro du tube où la hauteur de

mousse est égale à 1 cm.

* Les coumarines : Fluorescence UV : A 2 ml d’extrait, 0,5 ml de NH4OH à 25 % sont ajoutés. Le mélange est par la suite observé sous UV à 366 nm. Une fluorescence intense indique la présence des coumarines.

* Stérols et triterpènes : La réaction de Liebermann Buchard : Après évaporation à sec de

10 ml de la solution à analyser, le résidu est dissous dans 5 ml d´anhydride acétique puis 5 ml de chloroforme.1 ml de H2SO4 concentré est ajouté au fond du tube sans agiter. Après 30 minutes, la formation d´un anneau rouge brunâtre à la zone de contact des deux liquides et une coloration violette de la couche surnageant révèlent la présence de stérols et triterpènes. * Anthraquinones libres: Réaction de Bornträger : 1ml d’extrait est mélangé à 1ml de NH4OH dilué puis agité. La coloration plus ou moins rouge indique la présence d’anthraquinones libres.

* Quinones libres : A 1 ml d’extrait, 0,1 ml d’hydroxyde de sodium (NaOH) à 10% est ajouté. L’apparition d’une couleur qui vire au jaune, rouge ou violet indique la présence des quinones libres.

* Anthocyanes : A 1 ml de l’extrait, 1ml d’HCL (2N) est ajouté. Si la coloration s’accentue par acidification, puis vire au bleu-violacée par addition d’ammoniac, cela indique la présence des anthocyanes.

* Les composés réducteurs : A 2 ml d’extrait, 2 ml de liqueur de Fehling sont ajoutés et l’ensemble est incubé 8 min dans un bain marie bouillant. L’apparition d’un précipité rouge brique indique la présence des composés réducteurs.

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1.1.3.2. Analyse chromatographique par RP-HPLC-PDA de l'extrait phénolique du gel d’Aloe vera

L'analyse des composés phénoliques est réalisée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse, sur un système Perkin Elmar Flexar équipé d'une pompe binaire et d'une colonne Eclipse ODS Hypersil C18 (150 mm X 4,6 μm). La phase mobile consiste en un solvant A-acide acétique (2%) et B-acétonitrile. Le système d'élution à gradient est à 5 min avec 15% de B; 25 min avec 98% de B et 15 min de gradient linéaire de 95% à 100% de B; après cela, 15 min sont constituées pour l'équilibrage. Le débit est de 0,8 ml / min. Les pics sur les chromatogrammes sont détectés à 280 nm. L'identification des composés et l'attribution des pics sont effectuées en fonction de leurs temps de rétention et en les comparants avec des standards de référence. Le chromatogramme obtenu avec le gel d’Aloe vera est donné dans la Figure 7.