Détermination des acides gras volatils par automatisation en flux avec détection par

III.3.1. Analyse en microplaque

L’analyse multi-échantillons pour la détermination des acides gras volatils (AGV) par microplaque de 96 puits a été développée par l’équipe de Chimie de l’Environnement Continental de l’Université de Provence. Cette méthode est simple, précise et présente une procédure similaire à celle qui a été mise en œuvre et décrite par Robert-Peillard et al. (2009). La méthode précédente utilise un réactif d'activation de la fonction carboxylique (carbodiimide soluble dans l'eau, EDC) et un réactif aminé de dérivation fluorescent (N-(1-naphtyl) éthylènediamine, EDAN). La séparation du dérivé-AGV fluorescent et du réactif fluorescent a été modifiée afin d’être appliquée au format microplaque. La nouvelle procédure utilise l’O-phthaldialdéhyde (OPA) afin de faire un quenching de fluorescence de l’EDAN. Cette procédure a un pH optimal de 7 et s’effectue au sein du lecteur de microplaques à une température proche de 40°C. Cette procédure, une fois optimisée, a été appliquée à divers acides carboxyliques et à d'autres composés organiques, ce qui a permis de montrer que les AGV présentent les réponses de fluorescence les plus élevées avec des résultats homogènes pour les principaux AGV (acide acétique, propionique, butyrique et valérique). Après application à des échantillons réels (boues issues de stations d'épuration ou issues d’usines de méthanisation des déchets d’ordures ménagères), la comparaison des résultats obtenus par notre méthode alternative avec ceux obtenus par la méthode de référence (chromatographie en phase gazeuse et détection par ionisation de flamme) a montré que les deux méthodes étaient équivalentes en termes de résultats et de précision. Ceci démontre le grand potentiel de notre méthode d'analyse des acides gras volatils en microplaques. Les détails de cette méthode analytique sont présentés dans une publication soumise au journal Analytical Chemistry en septembre 2010.

III.3.2. Analyse en Flux

III.3.2.1. Automate développé

Le protocole adopté pour la réalisation de notre automate de détermination des concentrations en AGV, est basé sur une technique combinée MSFIA-MPSF ; celle-ci a été a été retenue du fait de sa robustesse et de sa versatilité. La méthode analytique utilisée dans cette analyse en flux est inspirée

CHAPITRE III : Résultats et discussions

du protocole alternatif développé par Robert-Peillard et al. (2009). Le montage utilisé pour l’analyse en flux est présenté dans la figure 66.

Figure 66 : Représentation schématique du système d’analyse en flux pour la détection des acide gras volatils (MP : Multipompes, HC: Boucle d’attente, S : Seringues, V : Valves de commutation)

La procédure automatisée pour la détermination en ligne des AGV est représentée dans le tableau 25 et peut se résumer de la façon suivante :

Étape d’activation : Dans cette première étape, l’échantillon (400µl) est aspiré dans la boucle d’attente (HC-1) par la seringue S1, après l’activation de la vanne V6, tandis que les deux autres seringues (S2-S3) sont remplies des solutions d'EDC et HOBT / EDAN. L’échantillon, l’EDC

V1 S1 V6 V2 S2 V3 S3 V4 S4 V7 V5 S5 MP1 MP2 MP3 HCl NaOH Réacteur de mélange Poubelle phase aqueuse Echantillon Module d’extraction Spectrofluorimètre Poubelle phase organique Tampon Phosphate Tampon Phosphate MTBE HOBT EDAN EDC HC-1 HC-2 PC Membrane (PTFE) OFF ON OFF ON OFF

CHAPITRE III : Résultats et discussions

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(50 µl) et la solution mixte d’HOBT/EDAN (900 µl) sont ensuite injectés simultanément avec un débit de 15 ml/min dans le réacteur de mélange. L’attente de réactifs et l’échantillon dans ce réacteur est de 120 secondes.

- Étape d’amidation : Dans cette deuxième étape, 70 µL de NaOH à 1 mol.L-1 sont injectés à 2,3 ml/min par la micropompe 1 (MP1) dans le réacteur de mélange, afin d'augmenter le pH à 8 ; ce pH permet d’assurer la formation de l’amide fluorescente (dérivé fluorescent) produite par la réaction entre le produit intermédiaire activé et l’amine fluorescente EDAN.

- Étape d’acidification : Après 30 secondes d’attente, la micropompe 2 (MP2) injecte 80µL d’HCl à 1 mol.L-1 à 2,3 ml/min dans le réacteur afin d’atteindre un pH de 2,5 ; ce pH permet d’assurer une séparation optimale entre l’amine initiale (EDAN) et l’amide formée, durant l’étape d’extraction liquide-liquide réalisée dans l’étape suivante.

- Étape d’extraction : Au cours de cette étape, le mélange échantillon - réactifs est aspiré dans la deuxième boucle d’attente (HC-2) par la seringue 4 (S4). Après l’activation de la valve 7 (V7), le mélange réactionnel et le solvant d’extraction (MTBE) sont injectés simultanément par des seringues (S4 et S5) dans la cellule d’extraction. Cette cellule est dotée d’une membrane PTFE permettant de séparer les phases organique et aqueuse.

- Étape de rinçage du réacteur de mélange : Cette étape est effectuée parallèlement à l’étape d’extraction. En effet, au moment de l’aspiration du mélange réactionnel vers HC-2, la seringue 2 (S2) injecte 1ml du liquide vecteur (tampon phosphate) afin de nettoyer le réacteur de mélange.

- Étape de rinçage de la cellule d'extraction : Suite à la séparation de phases par la membrane dans la cellule d’extraction, le dérivé fluorescent désiré reste dans la phase organique, et est dirigé vers le détecteur de fluorescence; la phase aqueuse est orientée vers les déchets. Après l'enregistrement des données intensité de fluorescence à 335 nm et 395 nm, respectivement pour les longueurs d'onde d'émission et d'excitation, le liquide vecteur et le MTBE sont injectés afin de nettoyer la cellule d’extraction. Enfin, la micropompe 3 (MP3) est activée pour vider le réacteur de mélange, avant de commencer un nouveau cycle d'analyse.

CHAPITRE III : Résultats et discussions Tableau 25 : Procédure automatisée de détermination des acides gras volatils

Position des valves Position des micropompes

Volume

injecté Débit

Etape Mode

V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 MP1 MP2 MP3 ml ml min-1

Dispense Off Off Off Off Off Off Off Off Off Off 0.4 15

Aspire On Off Off Off Off Off Off Off Off Off 0.4 15

Dispense On Off On Off Off On Off Off Off Off 0.4 15

Dispense Off On On Off Off Off Off Off Off Off 0.1 15

Dispense Off Off On Off Off Off Off Off Off Off 0.4 15

Aspire Off Off Off Off Off Off Off Off Off Off 0.9 15

Activation

Attente 120 Seconds

Dispense Off Off Off Off Off Off Off On Off Off 0.07 2.3

Amidation

Attente 30 Seconds

Dispense Off Off Off Off Off Off Off Off On Off 0.08 2.3

Dispense Off Off Off Off Off Off Off Off Off Off 1.2 15

Acidification

Aspire Off Off Off On Off Off Off Off Off Off 1.0 15

Dispense On Off Off Off Off On Off Off Off Off 0.5 15

Aspire Off Off Off Off Off Off Off Off Off On 0.6 2.3

Dispense On Off Off Off Off On Off Off Off Off 1.0 15

Rinçage du réacteur de mélange

Aspire Off Off Off On Off Off Off Off Off Off 0.2 15

Extraction Dispense Off Off Off On On Off On Off Off Off 3.5 2.0

Dispense Off Off Off On On Off On Off Off Off 1.5 5.5

Aspire Off Off Off Off Off Off Off Off Off On 1.0 2.3

Rinçage de la cellule

CHAPITRE III : Résultats et discussions

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III.3.2.2. Présentation et optimisation des paramètres influençant la dérivation en flux des acides gras volatils

La dérivation des acides gras volatils par notre système en flux est influencée principalement par des facteurs tels que le pH d’activation et d’amidation ainsi que par le débit d’extraction. Afin d’obtenir le meilleur rendement de dérivation et d’extraction du dérivé, ces facteurs ont été optimisés.