La détection des autres STEC

Les différentes méthodes décrites pour la détection des STEC non-O157 reposent essentiellement sur la détection de la production des Shiga-toxines, en général après une étape d'enrichissement. Plusieurs tests ELISA ont été décrits. Certains d'entre eux utilisent des anticorps monoclonaux dirigés contre la toxine Stx, tandis que d'autres sont basés sur la propriété des Shiga-toxines à se lier aux glycolipides présentant une terminaison α-D-Gal-(1-4)-D-Gal, des récepteurs Gb3 purifiés, du lyso- Gb3 ou du liquide de kyste hydatique. Dans les différents protocoles, la détection est réalisée à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la toxine stx, et la révélation avec des anticorps liés à la phosphatase alcaline. Cependant, ces méthodes ne se sont pas révélées aussi sensibles que le test sur cellules Vero. En outre, sachant que les variants stx n’ont pas tous la même

antigénicité et les mêmes propriétés de fixation, leur détection n'est pas garantie (Smith and Scotland, 1993).

Parmi les kits ELISA disponibles, on peut citer le « Premier EHEC » ciblant les Shiga-toxines (Meridian Diagnostics Inc, USA) et qui a été évalué dans les selles par Kehl et al. (1997) et par Mackenzie et al. (1998). Ce test est effectué en microplaques directement à partir des échantillons ou après enrichissement et il a été jugé adéquat pour la détection des STEC en routine. Le « Premier EHEC » a également été comparé par Willford et al. (2009) avec deux autres kits ELISA disponibles dans le commerce, le « Ridascreen Verotoxin Enzyme Immunoassay » (rBiopharm, Germany) et le « ProSpecT Shiga-Toxin E. coli Microplate Assay » (Remel Inc.) qui sont réalisés en microplaques à partir d’un échantillon enrichi. En revanche, les trois tests se sont montrés incapables de reconnaître les variants Stx2d et Stx2e ce qui indique que les souches de STEC exprimant ces variants ne seront pas détectées par ces méthodes.

Des kits utilisant la technique de « reverse passive agglutination assay » (RPLA) adaptés à la détection des toxines stx ont également été conçus et commercialisés. Cette technique met en jeu des billes enduites d’anticorps qui interagissent avec les Shiga-toxines et produisent une couche diffuse à la base des puits où se déroule la réaction. Karmali et al.(1999) ont comparé à partir de cultures pures le kit « VEROTOX-F » (Denka Seiken, Japon) avec le test sur cellules Vero et ont observé une sensibilité de 0,7 ng.ml-1 et 0,6 ng.ml-1 pour stx1 et

stx2 respectivement. Ce test pouvait détecter stx1, stx2 et le variant stx2c. Le « VTEC RPLA » (Unipath Limited, Royaume-Uni) a été évalué par Beutin et al. (1996) à partir de surnageant de culture pure de STEC pathogènes traité avec de la polymyxine. Les souches de STEC testées ont ainsi été isolées et le variant stx1 ou stx2 a été déterminé de façon fiable en 72 à 96 heures. Un autre kit, le « STEC-Screen « Seiken » RPLA » a également été évalué et comparé avec le test sur cellules Vero par Beutin et al. (2002), à partir d’échantillons de selles. Ce test s’est montré précis, rapide, facile d’utilisation et adapté à l'examen en routine.

Des méthodes d’immunochromatographie utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques des Shiga-toxines ont été également développées. Ces méthodes permettent une détection rapide, en moins de 10 min pour le « Duopath verotoxin test » (Merck, Germany) (Park et al., 2003). Ce test a été comparé au « Premier EHEC », utilisé comme référence, et a montré une absence de réaction croisée avec d'autres organismes entériques.

La méthode IMS a également été adaptée à la détection et l’isolement des souches appartenant aux 5 sérogroupes majeurs de STEC, à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps dirigés contre les antigènes O26, O111, O103 et O145 (disponibles dans le commerce, Dynal

Ltd, Norvège). Toutefois, les souches isolées par cette méthode doivent être confirmées pour la présence du gène stx avant d’être considérées comme des souches de STEC. Ces billes magnétiques n'ont pas été certifiées ISO comme l'IMS pour E. coli O157:H7, mais ont été employées pour aider à récupérer des souches de STEC à partir d'échantillons alimentaires (Auvray et al. 2007).

Il n’existe pas de méthode validée normalisée pour la recherche des STEC non-O157 dans les aliments. Toutefois, quelques méthodes sont disponibles sur le marché. Il existe par exemple, une méthode génétique : la société Genesystems a mis au point un « GeneDisc » qui permet la détection simultanément des gènes ciblant les sérotypes d’E. coli O26, d’E. coli O103, d’E. coli O111, d’E. coli O145 et du gène ciblant FliC H7. Ce système utilise les amorces validées et décrites par Perelle et al. (2004).

Il existe un grand nombre de tests en PCR conventionnelle pour la détection des gènes wzx et wzy impliqués dans la constitution des antigènes somatiques O26, O103, O111 et O145 (Wang et al., 1998 ; Debroy et al., 2004 ; Fratamico et al., 2005, Fratamico et al., 2009). Des modèles de détection par PCR en temps réel des gènes wzx de O26, wbdI de O111, wzy de O145 ont également été conçus (Perelle et al., 2004, Fratamico et al., 2009). Les PCR en temps réel pour la détection de wzx-O26, wzx-O103, wbd1-O111 et rfbE-O157 ont été combinés avec le marqueur ihp1-O145 au sein d’une multiplex pour réaliser le criblage d’échantillons alimentaires d'origine bovine (Perelle et al., 2007).

Une méthode immunologique, le VIDAS EES est également disponible. Celle-ci permet la détection simultanée des E. coli O157 et O26 sans pouvoir faire la distinction entre les deux.

La demande se faisant de plus en plus forte et l’apparition des sérogroupes autres que O157 étant de plus en plus fréquente dans les épisodes épidémiques, un projet de normalisation d’un protocole visant à leur détection est actuellement à l’étude (Figure 16).

Figure 16 : Projet de normalisation d’une méthode de recherche des STEC appartenant aux sérogroupes O157,

O111, O26, O103 et O145.

Ce protocole repose sur deux grandes étapes : le dépistage puis la confirmation (Figure 17). L’étape de dépistage consiste en un enrichissement puis à la détection dans le bouillon en premier lieu des facteurs de virulence (eae et stx) par une technique de PCR en temps réel et si l’échantillon est positif pour ces deux cibles alors on recherchera par PCR également s’il y a présence ou non d’un ou plusieurs des 5 sérogroupes. Les amorces et sondes utilisées sont celles publiées par Perelle et al. (2004,2005) et Nielsen et al. (2003).

Si l’un des 5 sérogroupes est détecté, on passera à l’étape de confirmation qui consiste en une immunoconcentration bactérienne puis à un isolement sur géloses. Si des colonies caractéristiques apparaissent, alors il faudra confirmer que ces colonies appartiennent bien au sérogroupe suspecté et les caractériser.

Figure 17 : Projet de normalisation : protocole de recherche des STEC appartenant aux sérogroupes O157,

O111, O26, O103 et O145.