Détection de l'interleukine-10 humaine recombinante par la mesure SIE

L'anticorps monoclonal de l'interleukine-10 (mAc IL-10) a été immobilisé sur la surface Si/SiO2/Si3N4-(SPy-PPy)-CMA comme il a été décrit précédemment dans la section expérimentale. La figure IV.10 montre les diagrammes de Nyquist de l'immunocapteur analysé dans la solution tampon PBS à pH 7,4 à un potentiel appliqué - 0,1 V/ECS ; avec une amplitude de 25 mV, dans une gamme de fréquences de 100 kHz à 50 mHz. Le premier demi-cercle (a) correspond à mAc IL-10 (100 μg/ml) immobilisé sur la surface du substrat Si/SiO2/Si3N4-(SPy- PPy)-CMA. Ensuite, l'immunocapteur a été incubé à diverses concentrations d'antigène de cytokine rh IL-10 : (b) 1 pg/ml, (c) 5 pg/ml, (d) 10 pg/ml, (e) 30 pg/ml et (f) 50 pg/ml, dans la solution tampon PBS pendant 30 min à 4°C. L'immunocapteur a été lavé après chaque période d'incubation avec une solution de PBS pour éliminer toute cytokine rh IL-10 non liée. Comme le montre clairement la figure IV.10, les diagrammes de Nyquist montrent une augmentation de la résistance de transfert de charge (𝑅𝑐𝑡) avec la concentration de cytokine rh IL-10, ce qui confirme la bioreconnaissance de cytokine rh IL-10 par des sites spécifiques de l'anticorps mAc IL-10 immobilisé sur la surface active (CMA) de l'électrode.

Figure IV.10. Diagrammes de Nyquist : (a) substrat Si/SiO2/Si3N4-(SPy-PPy)-CMA immobi-

lisé avec mAc IL-10 (100 μg/ml) pendant 1 h à 4 °C et après incubation avec rh IL-10 à diffé- rentes concentrations pendant 30 min à 4 °C : (b) 1 pg/ml, (c) 5 pg/ml, (d) 10 pg/ml, (e) 30 pg/ml et (f) 50 pg/ml, sur une gamme de fréquences comprise entre 100 kHz et 50 mHz, avec une perturbation de 25 mV.

Les diagrammes d'impédance obtenus à différentes concentrations de rh IL-10 ont été ajustés en utilisant le modèle de circuit équivalent afin de normaliser les paramètres électrochi- miques de PPy modifié par une couche de CMA immobilisé avec mAc IL-10 et après incubation avec rh IL-10 à différentes concentrations [26]. Le circuit électrique équivalent appliqué pour la simulation qui a formulé le meilleur ajustement pour les données est celui appliqué dans le cas de substrat modifié par le polypyrrole (figure IV.6).

Afin de comparer les différentes mesures de l'immunocapteur dans des conditions équi- valentes, on utilisait les valeurs relatives ∆ 𝑅 𝑅⁄ = (𝑅𝑐𝑡− 𝑅𝑐𝑡𝑜)/𝑅𝑐𝑡𝑜, où 𝑅𝑐𝑡𝑜 et 𝑅𝑐𝑡 sont res- pectivement la résistance au transfert de charge de l'immunocapteur avant et après la biore- conaissance de rh IL-10. La figure IV.11 montre le diagramme d'étalonnage dérivé, il corres- pond à la résistance de transfert de charge à l'interface de détection en fonction de la concen- tration de rh IL-10. Une bonne relation linéaire (𝑦₁ = 0,0527𝑥₁+ 0,2093 avec 𝑅₁2 = 0,9911) a été observée dans la plage de concentration étudiée de rh IL-10 de 1 à 50 pg/ml.

Figure IV.11. Courbes d'étalonnage décrivant la variation ΔR/R du substrat Si/SiO2/Si3N4- (SPy-PPy)-CAM pour la reconnaissance de divers antigènes : (a) rh IL- 10, (b) rh TNF-α et (c) rh IL-8 pour différentes concentrations allant de 1 à 50 pg/ml.

Il est important de signaler que cette limite de détection élevée de l'immunocapteur déve- loppé pour la cytokine rh IL-10 est supérieure à celle obtenue dans les rapports publiés précé- demment [22, 26]. En outre, le biocapteur développé peut être utilisé pour tenir compte des concentrations plus importantes de cytokine rh IL-10, en raison de sa surface élevée.

Afin d'étudier la sélectivité de l'immunocapteur développé, d'autres interférences de cytokines comme facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-) et IL-8 ont été utilisées. Ces cytokines sont également sécrétées lors des processus d'inflammation, de sorte qu'elles peuvent représenter les principales interférences pour la détection de l'IL-10. Le même principe de détection a été utilisé pour ces deux cytokines en immobilisant le même mAc IL-10 sur l'immunocapteur PPy développé en déterminant la résistance relative ∆ 𝑅 𝑅⁄ .

Comme le montre clairement la figure IV.11, la détection des lymphocytes IL-8 et TNF-

a montré des relations linéaires similaires à rh IL-10 dans la limite de détection étudiée (de 1 à 50 pg/ml). Cependant, la pente des relations linéaires pour les deux interférences était considérablement très faible (𝑆3 = 0,0121 𝑝𝑔/𝑚𝑙 pour TNF- et 𝑆4 = 0,0042 𝑝𝑔/𝑚𝑙 pour IL-8) par rapport à la cytokine rh IL-10. Ceci confirme la sensibilité et la sélectivité supérieure de l'immunocapteur à la cytokine rh IL-10 que les autres cytokines parasites.

IV.3. Conclusion

Ainsi, une nouvelle méthodologie pour la fabrication d'un immunocapteur très sensible pour la détection ultrasensible de la cytokine interleukine-10 (IL-10) a été introduite. Le nouveau immunocapteur développé est basé sur la modification du substrat à base de Si3N4 avec une couche conductrice de polypyrrole fonctionnalisée par un carboxyle. Le substrat semi- conducteur à base de Si3N4 a été chimiquement modifié avec une couche de PPy en utilisant du FeCl3 comme oxydant après la silanisation de substrats Si/SiO2/Si3N4 avec SPy. Ensuite, le substrat obtenu (Si/SiO2/Si3N4-(SPy-PPy)) a été fonctionnalisé électrochimiquement (greffé) avec du diazonium fonctionnalisé par un carboxyle (CMA). Le greffage de CMA sur la surface du film PPy entraîne la diminution des courants anodiques et cathodiques, comme en témoignent les mesures de VC. Par conséquent, cela a entraîné une augmentation de la résistance de transfert de charge (𝑅_𝑐𝑡) du film PPy par rapport à celle non modifiée, comme le montre l'analyse SIE.

De manière plus intéressante, l'immunocapteur développé présente une sensibilité et une sélectivité élevée à la cytokine IL-10 dans la gamme de 1 à 50 pg/ml par rapport à d'autres interférences de cytokines (par exemple IL-8 et TNF-). Par conséquent, la méthodologie de détection actuelle représente un moyen attrayant et alternatif aux méthodes existantes pour la détection de l'IL-10. Ces résultats représentent un avenir prometteur pour la création d'immunocapteur exempts d'étiquettes à base de PPy et caractérisés par une stabilité chimique, une analyse rapide, une haute sensibilité et une sélectivité pour le diagnostic de maladies aux premiers stades d'une inflammation ou une infection à coût réduit.

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