A Tabela 7 apresenta o conteúdo de antocianinas monoméricas dos extratos PLE. A maior concentração de antocianinas foi obtida na extração com água e etanol (50%, m/m) com pH 2,0 a 40 oC e a menor foi obtida com a mistura hidroetanólica (50%, m/m) a 100 oC. Resultados similares foram encontrados para PLE a partir de resíduos de juçara (GARCIA- MENDOZA et al., 2017). Altas temperaturas podem influenciar negativamente o rendimento da extração de antocianinas, uma vez que estes compostos são termolábeis, sendo assim facilmente degradados. A degradação pode ser causada principalmente por oxidação, clivagem de covalente ligações ou reações de oxidação aumentadas devido ao processamento térmico. Já em meio ácido a extração de antocianinas tem maior rendimento devido à sua estabilidade em pHs entre 1,0 e 3,0, aumentando a sua solubilidade na água, e também pela ruptura da parede celular, levando a uma maior transferência de massa (KHOO et al., 2017; PERON; FRAGA; ANTELO, 2017; SANTOS; VEGGI; MEIRELES, 2012; TÜRKER; ERDOGˇDU, 2006). Diversos trabalhos também extraíram antocianinas a partir do bagaço de uva utilizando diferentes técnicas de extração. Melo et al. (2015) obtiveram 1,41 e 0,99 mg de Mv-3-glc/g de bagaço liofilizado na uva Syrah e Petit Verdot, respectivamente, utilizando o método de extração assistida com ultrassom. Rockenbach et al. (2011) observaram diferentes concentrações de antocianinas monoméricas (1,84-7,2 mg Mv-3-glc/g bagaço seco) ao analisar o seu rendimento em quatro variedades diferentes de uva (Cabernet Sauvignon, Merlot, Bordeaux e Isabel) utilizando o método de extração por agitação mecânica. Além do método de extração, variáveis relacionadas à tecnologia do processamento das uvas, cultivar, características genéticas e climáticas têm grande influência na recuperação de compostos vegetais (DOSHI; ADSULE; BANERJEE, 2006; PATRAS et al., 2010; TSENG; ZHAO, 2013).
Adams (1973) e Markaris et al. (1957) reportaram que existem dois mecanismos para a degradação de antocianinas. Um destes mecanismos seria a hidrólise seguida da abertura
do anel de pirilium na posição 1-2, formando uma chalcona e a posterior degradação adicional. levaria ao precipitado marrom, produto final da degradação do pigmento. O outro mecanismo é a clivagem da fração de açúcar e formação da aglicona, composto altamente lábil e instável. Estas considerações podem explicar a obtenção de extratos de coloração amarronzada nas extrações em temperaturas de 80 e 100 ºC.
5.1.2 FENÓLICOS TOTAIS (FT)
Na Tabela 7 pode ser observado que a temperatura de 100 oC favoreceu significativamente a extração de compostos fenólicos com etanol e água (50%, m/m). Isto se deve principalmente ao aumento de solubilidade e difusividade dos compostos de interesse no solvente em temperaturas elevadas, acarretando uma diminuição da viscosidade, tensão superficial e quebra das ligações químicas dos tipos van der Waals, ligação de hidrogênio e dipolo-dipolo, resultando assim em maior rendimento de extração (KIM et al., 2009; MUSTAFA; TURNER, 2011). Outros estudos também verificaram que o aumento da temperatura promoveu uma maior eficiência na recuperação de fenólicos através da PLE (GARCIA-MENDOZA et al., 2017b; JU; HOWARD, 2003; MACHADO et al., 2015). Rajha et al. (2014) relataram que a temperatura tem um efeito positivo sobre o rendimento de compostos fenólicos, porém em curtos períodos de tempo, porque após certo valor, a degradação destes compostos pode ocorrer.
Goula et al. (2016) compararam a capacidade de diferentes solventes (água, etanol, etanol aquoso 50%, etanol aquoso 70% e metanol aquoso 70%) na extração de compostos fenólicos por ultrassom. Obtiveram um rendimento máximo de 9,57 mg GAE/g dr, com etanol aquoso 50% e concluíram este solvente foi mais eficiente devido à adição de água no solvente etanol, criando um meio mais polar e, assim, facilitando a extração deste composto. Segundo Mustafa e Turner (2011), a utilização de uma mistura binária de solventes melhora eficiência de extração, pois enquanto o etanol aumenta a solubilidade do composto de interesse, a água auxilia na sua dessorção ao quebrar a ligação dele com a matriz. Aliakbarian et al. (2012) utilizaram água subcrítica na extração de fenólicos do bagaço de uva e na melhor condição de extração (140 ºC) alcançaram 32,49 mg GAE/dr. Além de temperatura, solvente e tipo da matriz, é importante considerar outros parâmetros como tempo de extração, taxa de solvente que afetam a recuperação de compostos da biomassa e também podem influenciar na eficiência das técnicas de extração.
Tabela 7. Conteúdo de Antocianinas Monoméricas (AM), Fenólicos Totais (FT) e Capacidade Antioxidante (CA) determinada pelos métodos ORAC e FRAP dos extratos obtidos do bagaço de uva obtidos em 40 minutos por PLE.
T ( oC) Solvente S/F AM (mg Mv-3-glc /g dr) FT (mg GAE/g dr) ORAC (µmol TE/g dr) FRAP (mg TE/g dr)
100 EA 253 1,90D ± 0,04 66A ± 2 772A ± 19 1452A ± 130 80 ET 218 5CD ± 1 37B ± 3 504BC ± 74 798BC ± 162 60 EA 218 8,8AB ± 0,7 33B ± 7 480BC ± 84 897B ± 146 40 EA 217 6,2BC ± 0,2 16,1C ± 0,7 277C ± 13 479BC ± 31 40 EA pH 2,0 217 10,2A ± 0,5 28,7B ± 0,3 572AB ± 23 478BC ± 10 40 AA pH 2,0 220 7AB ± 1 14,2C ± 0,9 269C ± 31 392C ± 32
Os resultados são expressos como média ± desvio padrão. As letras maiúsculas iguais na mesma coluna indicam que não há diferença entre os métodos de extração, no nível de 5% de significância, de acordo com o teste de Tukey. m/m: massa/massa. EA: etanol + água (50%, m/m). ET: etanol puro. EA pH = 2,0: etanol + água (50%, m/m). AA pH 2,0: água acidificada. S/F: massa de solvente/massa de matéria-prima. dr: bagaço seco. Mv-3-glc: malvidina-3-glucosídeo. GAE: ácido gálico equivalente. TE: Trolox equivalente.
5.1.3 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE (CA)
As capacidades antioxidantes dos extratos obtidos do bagaço de uva, avaliadas através dos ensaios FRAP e ORAC, estão apresentadas na Tabela 7. Nota-se que altas temperaturas na PLE afetaram as duas capacidades antioxidantes testadas. Os valores mais altos de ORAC e FRAP foram encontrados no extrato obtido a 100 oC com água e etanol 50/50 (%, m/m), coincidindo com a melhor condição de extração obtida para compostos fenólicos (ver Seção 5.1.2). Isto é um indicativo de que a capacidade antioxidante dos extratos se deve principalmente aos compostos fenólicos neles presentes. Para detectar possíveis correlações entre FT e CA dos ensaios ORAC e FRAP nos extratos PLE, a correlação de Pearson foi determinada, como mostra a Tabela 8. Os testes de correlação indicaram coeficientes altos e positivos de Pearson (valor-r) para FT e negativos para AM, quando correlacionados com ORAC e FRAP. Os valores de r indicam que as capacidades antioxidantes ORAC e FRAP estão fortemente relacionadas ao conteúdo de fenólicos totais. No entanto, as correlações entre AM
vs FRAP e ORAC apresentaram valores de p acima de 0,05 e valores de r distantes de -1 e 1, o
que significa que tais resultados não estão correlacionados. A significância estatística (valor p) na interação de confiança de 95% foi menor ou igual que 0,005 para ambas as correlações de ORAC e FRAP vs FT, mostrando uma relação estatisticamente significante entre estes resultados. Conclui-se, assim, que a capacidade antioxidante dos extratos do bagaço de uva se deve principalmente aos compostos fenólicos. Correlações e comportamentos semelhantes também foram relatados por Viganó et al. (2016b), Machado et al. (2017), Garcia-Mendoza et al. (2017b), Monrad et al. (2010b), Martins et al. (2016), Dai et al. (2009), Ju e Howard (2006). Comparando os métodos de determinação de capacidade antioxidante, os resultados de FRAP são maiores que os de ORAC. Esta diferença nos resultados já era esperada, uma vez que os mecanismos de ação são diferentes para cada ensaio.
Tabela 8. Matriz da correlação de Pearson obtida entre os ensaios de capacidade antioxidante (ORAC e FRAP) e composição do extrato (AM e FT) para as seguintes condições PLE: EA (100 ºC), ET (80 ºC), EA (60 ºC), EA (40 ºC), EA pH 2,0 (40 ºC), AA pH 2,0 (40 ºC). ORAC FRAP AM r -0,418 -0,714 p 0,409 0,111 FT r 0,940 0,958 p 0,005 0,003
EA: etanol + água (50%, m/m). ET: etanol puro. EA pH 2,0:
etanol + água (50%, m/m).AA: água acidificada.