Déte tion de l'ADN à l'aide de nano ristaux semi- ondu teurs

Cette étude, menée en ollaboration ave Christophe Es udé, se proposait de déte ter des molé ules d'ADN peignées en atta hant des NCs à leurs extrémités. La déte tion de longues molé ules d'ADN (plusieurs kilobases) ave des NCs n'avait jamais été réalisée auparavant à notre onnaissan e. Ce mode de déte tion présente de nombreux avantages par rapport à une déte tionutilisantdesuorophoresorganiques, ommeuninter alant(YOYO-1)ouunemolé ule s'insérant dansun sillonde l'ADN(SYBR) :

•

Le photoblan himent des omposés organiques limite la duréed'observation desmolé ules d'ADN et onduit à leur assure. La durée d'observation des molé ules d'ADN peut être augmentéeenéliminantl'oxygèneprésentensolution. Néanmoins,laduréemaximale d'ob-servationrestelimitéeàquelquesminutes,et esystèmen'agitpasdanstoutesles onditions expérimentale s; sone a ité estpar exemple trèsréduite àdespH

≥

8.

•

L'intera ti onde esuorophoresave l'ADNestd'origineéle trostatique.Ilestdon ae té par la salinité de la solution utilisée. Nous avons observé que le YOYO-1 et le SYBR ne teintent plus l'ADN pour des on entrations de Mg

2+

supérieures à 5 mM et en NaCl supérieuresà200mM.Or esionssontindispensablesàl'a tiondetrèsnombreusesenzymes et àleur étude.

•

Les molé ules d'ADN liées à des uorophores subissent des modi ations stru turelles, éle trostatiques et mé aniques. L'intera tion ADN-protéine dans es nouvelles onditions peut alors être modiée, voire empê hée [99,100℄.

Dans lase tionsuivante, nousverronsque noussommes néanmoinsparvenus àobserver l'in-tera tion d'E oRV ave un ADN marqué au SYBR Gold. Nous nous sommes pla és dans des onditionsparti ulière spour ela. Eneet,nousn'avonspaseubesoin d'observerl'ADNde ma-nièreprolongée, etnousavonsutiliséunuorophore (leSYBRGold)quin'empê hepasl'a tion d'E oRV,dansdes onditionssalines ompatiblesave lavisualisation del'ADN(faiblesalinité, pas de Mg

2+

). Néanmoins, l'étude des intera tions ADN-protéines pourrait devenir probléma-tique ave d'autres protéines ou ave dessolutions utilisées diérentes, notamment en présen e d'ions Mg

2+

à des on entrations pro hes des on entrations ellulaires, de l'ordre de 10 mM. Notreméthodede déte tiondesmolé ulesd'ADNpermetde s'aran hirdesproblèmes réperto-riés i-dessus. Nous avonspour ela synthétisé desmolé ules d'ADN modiées himiquement à leurs extrémités.Aprèspeignage, esextrémitéspeuventêtre déte téesàl'aidedenano ristaux. Les ouleurs desNCsutilisés peuvent être diérentes, de manièreà déterminer l'orientation des molé ules.

Substrat ADN

La déte tion de molé ules d'ADN par des NCs né essite la on eption et la fabri ation de substrats d'ADN dont lesextrémités ont une anitéforte pour les NCs. Nousavonsdon ligué desfragmentsd'ADN(d'environ500kilobases) ontenant desnu léotides modiés (ave biotine ou digoxigénine) aux extrémités desmolé ules d'ADN d'intérêt. Après peignage, es fragments peuventensuiteêtrerévélésgrâ eàdesNCs ouvertsdestreptavidine(notésNCs-streptavidine) ou des NCs ouverts d'anti orps. Notre proto ole permet de ontrler la taille des fragments ligués, et ore également la possibilité d'in orpore r un nombre élevé et onnu de nu léotides modiés.Iladon étépréféréàd'autresproto olesplus ourts, ommelapolymérisationdire te, par une polymérase de Klenow, de quelquesnu léotides modiés aux extrémités desmolé ules d'ADN, qui ne présentaient pas es avantages. Le le teur trouvera les proto oles détaillés dans

l'arti le orrespondant enannexe.

Atta hement des NCs surles molé ules d'ADN peignées

Deux voies s'oraient à nous au début de e projet : atta her des NCs aux extrémités de l'ADNpuispeigner esmolé ules(1),oupro éderdansl'ordreinverseetatta herdesNCssurdes molé ulesdéjàpeignées(2).Laréalisationde(1)nousasembléprésenterdesobsta lesbeau oup plus grands que elle de (2). En eet, un nano ristal étant sus eptible de se lier ave plusieurs groupements biotine (pouvant appartenir à des extrémités de molé ules d'ADN diérentes), l'expérien e doit être onduite en large ex ès de NCs pour éviter le ross-linking desmolé ules d'ADN e quipose ledéli atproblème deleur puri ationultérieure. Deplus, ilest expérimen-talementdi ile detrouverdes onditionsdanslesquellesonpuissepeignerlesmolé ulesd'ADN tout en évitant une intera tion importante des NCs ave la surfa e. Une fois onçu et fabriqué l'ADNdé rit pré édemment ,le proto ole (2)ne présente plusqu'une di ulté : déterminer des onditions expérimentales dans lesquellesl'adsorption non-spé ique des NCs est la plus faible possible.

Traitement des lames ontre l'adsorption non spé ique des nano ristaux

(a) _{(b) (c)}

Fig.12 Adsorption des nano ristaux-streptavidine 605nm sur des lamessans/ave traitement des lames ave une solution de aséine. Dans les 3 as les lames sont re ouver tes pendant 10 min de 100

µl

d'une solution de nano ristaux (à 2 nM dans le tampon Borate 40 mM pH 8.3, NaCl100mM)puisrin éesave letamponBorate40mMpH 8.3.(a)Enl'absen e detraitement préalable,lalamedeverre+polystyrèneest re ouvertedenano ristaux(b)Aprèsuntraitement de la lameave 1.5mg/ml de"Blo king Reagent",seuls quelquesspots denano ristauxsontvisibles surla surfa e ( )Quandle"Blo king Reagent" estenplusajouté(à0.3mg/ml) dansla solution de nano ristaux,l'adsorption non-spé ique des nano ristaux est quasiment supprimée.

Enl'absen edetraitement,lesNCss'adsorbentmassivementsurlessurfa es,aussibien hydro-philes(lamedeverrenontraitée)qu'hydrophobes(lamedeverrere ouvertedepolystyrène).Une étape de traitement des surfa es est don né essaire. Les premiers essais utilisant des solutions diluéesdeBSAoule"tampond'in ubation"fournietre ommandéparQuantumDots Corpora-tionont onduitàdesrésultatspeu on luants. Enrevan he,l'utilisationde solutionsdiluéesde aséine ("Blo king Reagent", Ro he) supprime presque entièrement l'adsorption non-spé ique desnano ristauxsurlasurfa e (gure 12).

Résultats

Après in ubationet rinçage, noussommes parvenus àmarquer spé iquement les extrémités de l'ADN peigné. Des images réalisées à partir de molé ules d'ADN présentant une extrémité biotine, une extrémité digoxigénine, deux extrémités biotine ou une extrémité biotine et une extrémité digoxigénine sont représentées sur la gure 13. La gure 14 illustre la diéren e de photostabilitéd'unuorophoreorganique ommeleYOYO-1etdesnano ristaux.Lauores en e desmolé ulesd'ADNteintéesauYOYO-1 dé roîtprogressivementau oursdutemps,alorsque e n'est pasle aspour lesnano ristaux.

10 µm

Fig. 13 Déte tion des molé ules d'ADN peignées (images superposées d'ADN et NC). L'ADN estmarquéauYOYO-1(envert).Lesextrémitésbiotinesontdéte téesave desNCs-streptavidine 565 (D) ou 605 (A et C) (en rouge). Les extrémités digoxigénine sont déte tées ave de l'anti-digoxigénine desouris puis des NCanti-souris 655(B et D)(en bleu). Quatre types d'ADNont été utilisés : une extrémité biotine (A), une extrémité digoxigénine (B), deux extrémités biotine (C), une extrémité biotineet une extrémité digoxigénine (D)(barres : 10

µm

).

10 µm

Fig.14 Observationsimultanée demolé ules d'ADNetdenano ristaux. Lesmolé ules d'ADN ont été liguées à deux extrémités biotine, marquées auYOYO-1et peignées. Les extrémités sont déte tées ave des nano ristaux streptavidine à 605 nm. Un lm de 60 images (temps d'exposi-tion: 1 s) est réalisé au moyen d'unltre d'émissionpasse-long.Comme lemontrentles images extraitesde e lm,la uores en e desmolé ules d'ADNmarquéesauYOYO-1diminueau ours dutemps (è hes) etnepeutplusêtre observée après quelquesdizainesdese ondes, alorsque les NCs (triangles) nesontsujets qu'à un lignotement intermittent.

Nousavonsdéterminé,pour haquetypede ouplage,l'e a itédedéte tiondel'ADNpeigné en olo alisantNCsetADNmarquéauSyBr.Lorsquel'ADNpossèdeuneseuleextrémitébiotine, environ60

%

desmolé ules peignéessont marquées ave un nano ristal. Dans 90

%

des as, les NCs olo alisés ave l'extrémité d'une molé ule d'ADN sont situés à sonextrémité supérieure,

qui est la première à s'être a ro hée à la surfa e pendant le pro essus de peignage. Cette observationsuggèrequelesextrémitésmodiéess'a ro hent demanièreprivilégiéeàlasurfa e. Un tel eet avait déjà été observé dans l'équipe ave des molé ules d'ADN liées à des triples-héli es[101℄.Lorsquel'ADNpossèdeuneextrémité digoxigénine,ladéte tions'estfaiteendeux étapes:l'ajoutd'anti-digoxigé ninedesourispuisdeNCsanti-souris.Làen ore,environ60

%

des molé ulespeignéessontmarquéesave unnano ristal,situédanslaplupartdes asàl'extrémité supérieure, omme pour le marquagebiotine.

Lorsquelesdeuxextrémitésdel'ADNpossèdentunfragmentmodié,laproportionde molé- ules dont les deux extrémités sont olo alisées ave des NCs est d'environ 50

%

. Pour 40

%

des molé ules, une seule extrémité estmarquée, les résultatsétant à nouveau omparables pour les deuxtypesdemarquage. Dansle asdumarquagemixtebiotine/digoxigénine, environlamoitié de es molé ules est marquée à son extrémité biotine, l'autre moitié à son extrémité digoxigé-nine.Cesrésultatssontrelativement ohérentsave laprobabilité dedéte tiondeP=60

%

d'une seule extrémitémodiéemesuréepré édemment,qui méneraitàdesprobabilitésrespe tivement égales à 36

%

et 48

%

pour la déte tion de respe tivement deux et un NC(s) aux extrémités des molé ules d'ADN. Dans le as d'un marquage mixte, nousavons observé que les molé ules d'ADN s'étaient, dans 90

%

des as, a ro hées initialement par l'extrémité digoxigénine pen-dant la phasede peignage. Les extrémités digoxigénine ont don une anité plus forte pour la surfa e queles extrémitésbiotine. Le faitquel'e a ité de déte tionmesurée soit del'ordre de 60

%

, bien inférieure à 100

%

, ne peut être expliquépar le rendement (supérieur à 95

%

) de la ligation desfragmentsde PCRauxextrémitésdu plasmide linéarisé. Enrevan he, au un indi e expérimental ne permet d'établir ave ertitude que les molé ules d'ADN peignées onsidérées sont entières, lataille apparente demolé ules d'ADN peignées identiques étant soumise à d'im-portantesu tuations. Ilestdon possiblequ'unepartie desstatistiquesaitétéee tuéesurdes molé ulesnonentières,desortequel'e a itéréellededéte tiondesextrémitésmodiées pour-rait dépasserlesvaleurspré édentes. Enn, le lignotement fréquemment observé pour les spots situés aux extrémités des molé ules d'ADN indique que es spots sont généraleme nt omposés d'un ou dequelquesNCs.

Nousavonsensuiteexaminédansquellemesurelesmolé ulesd'ADNpouvaientêtrelo alisées par l'analysedesimagesdeNCs,enrepérant lespairesdeNCs tellesque1) ladistan eentreles deux uorophores orrespondait à lalongueur de l'ADN peigné (soit3

µ

) et 2) leur orientation orrespondaitàladire tiondepeignage.Ledétaildelapro éduresuivieestexposédansl'arti le en annexe,lerésultat essentiel est quedansle as d'un marquage ave deux extrémitésbiotine, onretrouvedel'ADNentreles pairesdéte tées ave uneprobabilité de 96

%

pour l'ADN.Cette probabilité est égaleà 63

%

pour l'ADNmixte biotine-digoxigénine.

Enn, l'ensemble du proto ole de marquage a été reproduit pour des molé ules d'ADN non plus peignées mais étirées. Nous avons malheureusement obtenus pour l'instant des résultats dé evants, sans qu'il nous soit possible de trouver la ause exa te de la faible proportion de molé ulesétirées marquées.

Detection of single DNA molecules by multicolor

quantum-dot end-labeling

Aure´lien Crut¹, Be´ne´dicte Ge´ron-Landre², Isabelle Bonnet¹, Ste´phane Bonneau^1,3,

Pierre Desbiolles¹ and Christophe Escude´^2,*

1

Laboratoire Kastler Brossel, Unite´ de Recherche de l’Ecole Normale Supe´rieure et de l’Universite´ Pierre

et Marie Curie, associe´e au CNRS, De´partement de Physique, 24 rue Lhomond, F-75005 Paris, France,

2

Laboratoire ‘Re´gulation et Dynamique des Ge´nomes’, De´partement ‘Re´gulations, De´veloppement et

Diversite´ Mole´culaire’, USM 0503 Muse´um National d’Histoire Naturelle, CNRS UMR5153, INSERM U565,

Case Postale 26, 43 rue Cuvier, F-75231 Paris Cedex 05, France and³CEREMADE, Universite´

Paris IX -Dauphine, F-75775 Paris, France

Received April 13, 2005; Revised and Accepted May 31, 2005

ABSTRACT

Observation of DNA–protein interactions by single

molecule fluorescence microscopy is usually

performed by using fluorescent DNA binding agents.

However, such dyes have been shown to induce

cleavage of the DNA molecule and perturb its

interac-tions with proteins. A new method for the detection

of surface-attached DNA molecules by fluorescence

microscopy is introduced in this paper. Biotin- and/or

digoxigenin-modified DNA fragments are covalently

linked at both extremities of a DNA molecule via

sequence-specific hybridization and ligation. After

the modified DNA molecules have been stretched

on a glass surface, their ends are visualized by

mul-ticolor fluorescence microscopy using conjugated

quantum dots (QD). We demonstrate that under

carefully selected conditions, the position and

orientation of individual DNA molecules can be

inferred with good efficiency from the QD

fluores-cence signals alone. This is achieved by selecting

QD pairs that have the distance and direction

expec-ted for the combed DNA molecules. Direct

observa-tion of single DNA molecules in the absence of

DNA staining agent opens new possibilities in the

fundamental study of DNA–protein interactions.

This work also documents new possibilities

regard-ing the use of QD for nucleic acid detection and

analysis.

INTRODUCTION

Over the past several years, single-molecule experiments have

provided new insights into the dynamics and function of DNA.

The physical properties of this natural polymer have been

investigated in detail, and there is a growing interest in

under-standing its interactions with proteins (1). Single molecule

studies of DNA typically involve enzymatic reactions along

extended molecules. These molecules are stretched by

anchor-ing one end so that individual DNA segments can be extended

and manipulated by various small forces such as electric or

dielectric force, viscous drag, surface tension, magnetic force

or optical force (2). One method for manipulating DNA is to

attach latex or magnetic beads to the molecules. The

move-ment of these beads also allows one to deduce the magnitude

of the force exerted on the molecules. Another approach

consists of visualizing the entire DNA molecule after staining

with a fluorescent dye such as the cyanine dimer YOYO-1 or

the groove binding agent SybrGreen. The processes of

condensation, denaturation and cleavage of the DNA shorten

the molecules sufficiently to be visible, thereby permitting

the observation of the action of a protein without

visualiz-ing the protein itself. This approach has been used to study

chromatin assembly (3), digestion by exonucleases (4) and

endonucleases (5), and denaturation induced by DNA

helicases (6).

In the absence of DNA staining organic dyes, observation of

enzymatic activity is still possible. A helicase activity has been

studied by using a combination of a surface immobilization

scheme and fluorescence resonance energy transfer between

two short end-labeled oligonucleotides (7). Another approach

consists in observing the incorporation of fluorescently

*To whom correspondence should be addressed. Tel: +33 1 40793774; Fax: +33 1 40793705; Email: escude@mnhn.fr

Correspondence may also be addressed to Pierre Desbiolles. Tel: +33 1 44323380; Fax: +33 1 44323434; Email: pierre.desbiolles@lkb.ens.fr

The authors wish it to be known that, in their opinion, the first two authors should be regarded as joint First Authors

The Author 2005. Published by Oxford University Press. All rights reserved.

The online version of this article has been published under an open access model. Users are entitled to use, reproduce, disseminate, or display the open access

version of this article for non-commercial purposes provided that: the original authorship is properly and fully attributed; the Journal and Oxford University Press

Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 11 e98

doi:10.1093/nar/gni097

labeled nucleotides. This has been done in two separate studies

for DNA (8) and for RNA (9) polymerases. In both studies,

DNA was elongated in a process resembling molecular

combing. This commonly used technique extends DNA

molecules linearly on a modified glass surface using a

receding meniscus (10). This method has proven extremely

useful for molecular cytogenetics or DNA replication studies.

Nevertheless, the level of overstretching (which can reach

50%) and the way the DNA molecule is attached to the surface

are critical factors when combed DNA molecules are used

as substrate for DNA binding proteins. We have recently

devised a method derived from molecular combing whereby

a DNA molecule, one end of which is attached to a surface, is

elongated by a water stream. The other end also eventually

attaches to the surface (11) resulting in an elongated, but not

overstretched molecule, the majority of which is free of the

surface.

This study and others emphasized two main drawbacks of

the use of DNA staining agents. The first is a decrease of

fluorescence over time (photobleaching). This process results

in the release of free radicals which induce cleavage of the

double-stranded DNA molecule. Although the duration of

fluorescence can be extended by reducing light intensity

and/or using oxygen radical scavengers, dynamic studies of

DNA–protein interactions require high illumination intensity

and long observation times to achieve both spatial and

tem-poral resolutions. The second drawback is that the presence of

these dyes results in changes in the electrostatic, structural and

mechanical properties of DNA which are likely to modify its

interaction with proteins. Enzymatic inhibition has been

repor-ted for restriction endonucleases (5,12) or exonucleases (4).

Moreover, these dyes are flushed away from DNA under

sodium and magnesium concentrations consistent with

enzym-atic activity (13). These limits constrain the use of this labeling

method for DNA–protein interaction studies.

Direct observation of a fluorescently labeled protein acting

on dye-free DNA has been reported only twice to our

know-ledge (14,15). In the first study, the movements of an RNA

polymerase were examined on a bundle of electrically aligned

DNA molecules. Sliding of the proteins along the DNA

molecules resulted in the deviation of proteins from bulk

flow. In the second study, total internal reflection microscopy

was used to observe the interactions of an RNA polymerase

with a DNA molecule which was positioned and elongated on

an engineered surface by using two optical traps. The

com-plexity of these experimental approaches plausibly explains

why they were not further exploited. Visualization of

fluores-cently labeled proteins interacting with combed DNA

molecules would present an interesting alternative if

per-formed in the absence of DNA staining agents.

In this paper, we report a new strategy for localizing single

DNA molecules in the absence of DNA-binding organic

fluorophores. The DNA molecules are labeled with biotin

or digoxigenin at both ends before they are combed onto a

glass surface. The detection scheme uses streptavidin- or

antibody-conjugated fluorescent quantum dots (QD). The

use of two different colored labels provides information

regarding the orientation of DNA molecules. Scanning of

the surface and selection of spatially concordant QD pairs

can be used to detect DNA molecules in the absence of

MATERIALS AND METHODS

DNA preparation

The following primers were synthesized by Eurogentec

(Seraing, Belgium): 5⁰

-CGCTTGGTCTCTGGGACGGTAT-CAGCTCACTCAAAG-3⁰ (fwB), 5⁰

-CGCTTGGTCTCTCT-GGCGGTATCAGCTCACTCAAAG-3⁰ (fwD) and 5⁰

-GGC-GATAAGTCGTGTCTTAC-3⁰ (rv). Primer fwB carries a

Dans le document Nanocristaux semi-conducteurs et interaction ADN/EcoRV (Page 42-55)