Dérivation de modèles PDOX d’épendymomes

Nous avons montré qu'il est possible de dériver des xénogreffes stéréotaxiques à partir de prélèvements chirurgicaux d’épendymomes infratentoriels et d’épendymomes supratentoriels réalisés au diagnostic et à la rechute par la méthode directe générant des PDOX. Le comportement clinique des souris est similaire à celui observé chez le patient : les souris présentent des symptômes neurologiques à un stade tumoral très avancé avec de volumineuses tumeurs. Le taux de prise des greffes reste très faible, inférieur à 30%, comparable au taux de prise de ces tumeurs en greffe sous-cutanée chez la souris nude (Gaspar et al., 2006). Cependant, il y aurait une tendance à une corrélation entre l’agressivité de la tumeur chez le patient avec la tumorigénicité in vivo comme déjà observé dans nos modèles de xénogreffes sous-cutanées dans le médulloblastome (Vassal et al., 1996). Tout comme pour le DIPG, la greffe de cellules tumorales congelées est possible. Compte tenu de la difficulté d’avoir accès à des jeunes souris NSG lors de la réception des échantillons tumoraux frais, il n’a pas été possible d’étudier la prise tumorale sur ces modèles fonctionnellement plus immunodéprimés. Cependant, le cerveau ne possède que très peu de cellules de l’immunité adaptative avec uniquement quelques lymphocytes T. La principale immunité du système nerveux central réside dans l’immunité innée apportée par les cellules microgliales, et ainsi le rejet des cellules tumorales par l’hôte dans nos modèles de xénogreffes stéréotaxiques doit rester faible (Filiano et al., 2015). La faible prise tumorale de ces modèles n’en est donc potentiellement pas la conséquence. De plus, le pourcentage de prise tumorale lors de la primogreffe est la même pour les épendymomes (EPN) au diagnostic et à la rechute. Une analyse génomique différentielle de tumeur au diagnostic et à la rechute montre qu’il y a très peu de variation dans l’altération du nombre de copies (Hoffman et al., 2014). De même, les profils transcriptomiques sont en partie conservés lors de la rechute. Les profils de méthylation des tumeurs au diagnostic et à leur rechute sont identiques, les tumeurs restant ainsi dans le même sous-groupe comme décrit par Pajter en 2015 (Ritzmann, 2018). Toutes ces données nous suggèrent que l’agressivité est semblable entre les tumeurs au diagnostic et à la rechute, ce qui explique que nous n’observons pas de différences dans nos xénogreffes. Cependant, en 2009, notre laboratoire a pu montrer que les tumeurs d’EPN à la rechute présentaient plus fréquemment un gain du chromosome1q ainsi qu’une augmentation de l’expression de la tenascine C par rapport aux tumeurs au diagnostic. Ces deux marqueurs étant associés à un mauvais pronostic, les tumeurs à la rechute sont donc considérées ici comme plus agressives.

67

Les analyses par IHC nous montrent que nos xénogreffes conservent le phénotype des tumeurs primaires d’EPN, à savoir la présence de pseudo-rosettes périvasculaires, d’une néoangiogenèse anarchique et la présence d’une masse tumorale très densément cellulaire. Pour les EPN-PF, les tumeurs ont tendance à envahir entièrement le 4^ème ventricule avec une extension dans l’espace sous-arachnoïdien. Pour l’EPN-ST, la tumeur semble envahir complètement le 3^ème ventricule avec une extension métastatique à distance du site d’injection. La possibilité d’avoir des PDOX marquées avec la luciferase nous a permis d’observer des métastases dans le rachis comme occasionnellement retrouvées chez les patients ainsi que des métastases intra-hémisphériques à l’aide de la fluorescence.

La difficulté d’obtention de modèles cellulaires in vitro pour les EPN est un vrai frein dans la connaissance biologique et préclinique de ces tumeurs, ainsi que pour le développement de CDOX. Historiquement, nous n’avons pu développer que des cultures in vitro à court terme avec l’utilisation de milieu contenant du sérum (Dantas-Barbosa et al., 2015). Cependant, il est reconnu que la culture de cellules tumorales dans du sérum induit une dérivation des cellules tumorales de la tumeur initiale du patient. Par exemple, dans le cas du glioblastome, l’utilisation de sérum pendant plusieurs passages successifs in vitro conduit à une perte d’hétérozygotie de la mutation dans TP53 ainsi que la présence d’anomalies dans le caryotype, contrairement aux cellules cultivées uniquement avec les facteurs de croissance EGF et FGF (Lee et al., 2006). De plus, ces cultures à court terme ne nous ont jamais permis de générer des modèles in vivo que ce soit en greffe sous-cutanée ou en greffe intracérébrale, les cellules n’étant pas tumorigènes.

Il a été montré que les EPN sont issus des cellules de la glie radiaire, progéniteurs des cellules souches neurales (NSC) (Taylor et al., 2005). Nous avons donc voulu cultiver in vitro ces cellules dans les mêmes conditions de culture que les NSC en neurosphères ou en culture monocouche sur de la laminine. Pour cela, du milieu sans sérum est complémenté en facteurs de croissance EGF et FGF. Ces conditions permettent de sélectionner uniquement les cellules présentant des caractéristiques de cellules souches tout en exprimant des marqueurs gliaux (Fael Al-Mayhani et al., 2009). Cependant, ces conditions de culture adaptées à la croissance des cellules souches gliales n’ont pas permis d’obtenir des lignées d’EPN stables. Très récemment, une équipe a réussi à obtenir des lignées d’EPN-ST issues de métastases à la rechute en culture 3D dans du milieu contenant du sérum sous forme d’agrégats multicellulaires non adhérents, mais interconnectés les uns aux autres (Amani et al., 2017). Ces cultures ont pu être maintenues jusqu’à un passage supérieur à 10. Histologiquement, les agrégats cellulaires présentent les mêmes structures avec des rosettes périvasculaires que les

68

tumeurs de patient. Il apparaît alors comme essentiel pour maintenir la prolifération cellulaire que les cellules d’EPN soient en contact très étroites les unes des autres afin de former une architecture tridimensionnelle leur permettant de se différencier et/ou de sécréter des facteurs solubles nécessaires.

2. Evaluations thérapeutiques in vivo dans le DIPG