3.1 Description
Au vu de la frontière des connaissances dessinée ci-avant, il apparaît clairement que le facteur de croissance endothélial vasculaire possède le potentiel de répondre aux défis de l’angiogenèse thérapeutique. Pour ce faire, un aspect-clef de la réussite semble lié au contrôle et à la modulation de son activité biologique. Le contrôle de la présentation de VEGF est en effet mené avec grande finesse dans le corps, et ce notamment au moyen de l’expression d’isoformes distinctes en réponse à des besoins spécifiques. Ces isoformes interagissent avec les divers composants de la matrice extracellulaire selon des cinétiques spécifiques. La concentration de VEGF et sa disponibilité en solution sont ainsi régulées pour favoriser la prolifération et la migration des cellules endothéliales. Le présent projet de recherche vise donc à répondre à l’hypothèse biologique suivante :
La sélection des voies de signalisation activées par la liaison entre VEGF et VEGF-R2, et ainsi la réponse cellulaire, peuvent être modulées par la
stratégie d’immobilisation employée, et notamment via la stabilité du facteur de croissance et sa capacité à être internalisé par les cellules
endothéliales.
Afin de vérifier l’importance de la dynamique d’interactions entre facteurs de croissance et la matrice extracellulaire, il nous faut mettre au point un système permettant d’immobiliser VEGF et de réguler sa libération. Notre regard s’est porté sur l’isoforme prédominante, VEGF165, et le
système superhélice non-naturel Ecoil/Kcoil (EVSALEK)5/(KVSALKE)5, ou E5/K5. L’hypothèse
biologique précédente se traduit alors par une hypothèse technologique :
Le système superhélice est suffisamment polyvalent et modulable pour permettre un contrôle adéquat de l’immobilisation, de la concentration et
3.2 Objectifs
Afin de valider ces hypothèses, trois pans majeurs du projet peuvent être dessinés. Dans un premier temps, il s’agit de valider que le système superhélice permet d’immobiliser VEGF165 sous une forme biologiquement active (objectif 1). Nous avons adopté à cette fin l’approche suivante :
(i). Produire une protéine chimère, dénommée E5-VEGF, correspondant à VEGF165
étiqueté avec le peptide E5;
(ii). Vérifier l’activité de la chimère en solution : stimulation de cellules endothéliales (portion VEGF165 de la protéine chimère) et capture sur un substrat solide par
interaction superhélice (portion E5 de la protéine chimère);
(iii). Vérifier l’activité de la chimère après immobilisation par interaction superhélice : stimulation de cellules endothéliales.
Dans un deuxième temps, il convient de démontrer que le système superhélice est largement modulable, en termes d’affinité et de stabilité (objectif 2). Pour ce faire, nous avons adopté l’approche suivante :
(iv). Concevoir et produire des variants du peptide K5;
(v). Vérifier l’activité des variants : capture d’E5-VEGF sur un substrat solide par interaction superhélice;
(vi). Vérifier que les variants confèrent à VEGF165 immobilisé une gamme d’affinité et de
stabilité dans le domaine déterminé ci-avant (Kd entre 20 pM et 200 nM, voir section
2.2.3.2) : mesure des paramètres cinétiques et thermodynamiques.
L’atteinte de tous ces objectifs permet la validation de l’hypothèse technologique et l’amorce de l’étude fondamentale pour valider l’hypothèse biologique. Ainsi, dans un troisième temps, il s’agit d’examiner la réponse de cellules endothéliales en présence de VEGF165 immobilisé par interaction superhélice (objectif 3). Pour ce faire, la méthode suivante a été déterminée :
(vii). Concevoir un substrat neutre permettant l’immobilisation spécifique et contrôlée de VEGF165 par interaction superhélice;
(viii). Déterminer les paramètres optimaux de greffage permettant le contrôle de la concentration et de la présentation de VEGF165;
(ix). Étudier le comportement de cellules endothéliales en présence de VEGF165 immobilisé
par interaction superhélice : mesure de paramètres cellulaires macroscopiques et moléculaires en fonction de la concentration de VEGF165 et des variants du peptide K5
employés pour l’immobilisation.
3.3 Organisation du document
Nous rapportons dans le Chapitre 4 la production et la caractérisation de la chimère E5- VEGF. L’étude, publiée dans le journal Acta Biomaterialia en juin 2013, a démontré que la chimère immobilisée promeut la survie de cellules endothéliales modèles (HUVEC) en conditions pro- apoptotiques, validant ainsi l’atteinte de l’objectif 1 (sous-objectifs i, ii et iii).
De plus, un résultat majeur a été obtenu lors de ces travaux : VEGF165 immobilisé par
interaction superhélice a démontré une très grande stabilité, largement supérieure à celle obtenue précédemment pour E5 ou le facteur de croissance épidermique étiqueté E5 (E5-EGF). Cette observation, qui a été attribuée à un phénomène d’avidité causé par la présence de deux étiquettes E5 sur la chimère dimère, a permis d’éclairer la conception des variants du peptide K5. En effet, la constante de dissociation pour l’interaction K5/E5-VEGF a été alors estimée inférieure au picomolaire. Afin de couvrir la gamme adéquate d’affinités proposées dans la sous-section 2.2.3.2, la conception des variants du peptide K5 s’est donc orientée dans le sens de la déstabilisation du complexe, afin de faciliter ultimement l’internalisation et/ou la libération de VEGF165. Cette
réflexion, détaillée dans la sous-section 5.9.1 et menée en collaboration avec le Prof. Robert S. Hodges à l’Université du Colorado, a abouti à la production de trois nouveaux peptides dénommés K5_1, K5_2 et K5_3. Leur capacité à recruter E5-VEGF a notamment été démontrée à l’aide d’un biocapteur SPR, réalisant ainsi les sous-objectifs iv et v de ce projet.
Il convient de noter que l’étude alors menée a dépassé le cadre du présent projet de recherche, notamment par l’emploi d’autres objets présentant un intérêt pour le génie tissulaire et la médecine régénératrice, porteurs d’un nombre variable d’étiquettes E5 : la chimère monomère E5-EGF et des nanoparticules modèles. Par le biais de ce second paramètre, c.à.d. le nombre d’étiquettes E5 en plus du choix du variant du K5, une gamme d’affinités très large (0,1 pM à 300
nM) et dépassant la gamme requise pour ce projet (20 pM à 200 nM) a pu être obtenue, validant ainsi le sous-objectif vi et ainsi l’objectif 2. Les résultats obtenus lors de cette seconde étude ont été publiés dans le journal Biomacromolecules en janvier 2017 et sont présentés dans le Chapitre 5.
Dans le cadre des sous-objectifs vii et viii, nous avons testés de nombreux substrats polymériques afin de déterminer leur capacité à assurer une immobilisation spécifique et contrôlée de la chimère E5-VEGF tout en permettant une bonne adhésion cellulaire. Durant ces recherches menées en collaboration au sein de l’équipe du Prof. De Crescenzo, un substrat permettant l’atteinte de cet objectif a été identifié : il comprend un revêtement de dextrane présentant des propriétés dites low-fouling (i.e. entravant l’adsorption de protéines et l’adhésion cellulaire) sur lequel des peptides du type RGD favorissant l’adhésion cellulaire sont greffés (Noel, Hachem, Merhi, & De Crescenzo, 2015).
Les contrôles menés lors des expériences relatives aux sous-objectifs vii et viii ont conduit à une découverte fortuite : une tendance prononcée du peptide K5 et/ou de la protéine E5-VEGF à s’adsorber sur de nombreuses surfaces. Afin de tirer profit de ce qui paraissait être de prime abord une limitation de notre stratégie de greffage (du fait d’interactions non spécifiques), nous avons mené une étude pour déterminer si les étiquettes E5 ou K5 permettaient l’adsorption orientée des biomolécules chimères. Ces résultats, rapportés dans le Chapitre 6 de cette thèse, mettent en évidence le potentiel d’une telle approche, en particulier pour Ecoil-VEGF combiné à des surfaces aminées.
Enfin, les outils nécessaires et l’approche expérimentale pour l’atteinte du sous-objectif ix et ainsi de l’objectif 3 – raffinée grâce au savoir-faire acquis lors de la réalisation des travaux scientifiques exposés – sont présentés dans Chapitre 7 de cette thèse.