Comme indiqué dans l’introduction de ce chapitre, il est aussi possible d’améliorer le contraste en utilisant la défocalisation avec des reconstructions numériques de la phase. Nous avons abordé ces questions en développant une approche simplifiée, que nous avons publiée dans l’article en annexe C. Un aspect important du travail a été la réalisation d’un plugin pour ImageJ qui permet d’appliquer cette méthode simplifiée et de la diffuser à un large public.
Article associé en annexe (Annexe C)
An ImageJ tool for Simplified post-treatment of TEM Phase Contrast Images (SPCI)
Verguet Amandine, Messaoudi Cédric, Marco Sergio et Donnadieu Patricia. Publié le 28 mars 2019
Parue dans la revue Micron https//doi.org/10.1016/j.micron.2019.01.006 Plugin SPCI http ://www.cmib.fr/fr/telechargements/softwares/SPCI.html
Sources https ://github.com/averguet/spci.git
4.2.1 Problématique
Comme expliqué dans l’introduction, le contraste des images de phase dépend de la défocali- sation. En défocalisant, on peut augmenter ou diminuer ce contraste. Il est classique de défocaliser fortement une image pour augmenter le contraste, ce qui engendre une déformation mais aussi une modification des contours de l’objet. L’image en contraste de phase ne montre pas l’objet lui même pour deux raisons. Tout d’abord, une image correspond à une intensité donc au module au carré d’une amplitude, l’effet de la lentille objectif s’exprime relativement simplement sur une amplitude à travers la fonction de transfert du microscope, il n’en est pas de même sur une in- tensité car l’information de phase est perdue. Ensuite, la CTF agit comme un filtre des fréquences spatiales et selon la défocalisation de la lentille objectif, les détails à certaines fréquences peuvent être atténués voir disparaître. Sur le principe, en utilisant un très grand nombre d’images défoca- lisées, on peut reconstruire une image de phase fidèle à l’objet.
Différentes approches de très haute résolution ont été développées notamment par C. Koch, elles sont basées sur des séries focales à grand nombre de termes et complétées par des simu- lations (Koch, 2014). Il s’agit de méthodes faisant appel à des algorithmes de reconstruction so- phistiqués et permettant d’atteindre des résolutions de l’ordre de l’angström. Toutefois, si on ne cherche pas une reconstruction à très haute résolution, la perte d’information correspondant aux hautes fréquences spatiales n’est pas gênante. Pour des objets dont la taille est supérieure à la di- zaine de nanomètres, on peut développer une méthode simplifiée utilisant un minimum d’images défocalisées.
Une méthode simplifiée a été proposé par (Donnadieu et al., 2008) qui permet de reconstruire l’image de phase à une résolution nanométrique à partir de 3 images défocalisées. Cette méthode a été validée sur des particules d’or. Lors de l’European Microscopy Congress (Lyon, 2016), nous avons établi une collaboration ayant pour but d’appliquer cette méthode à des objets biologiques et de développer un outil logiciel sous la forme d’un plugin pour ImageJ. Ce plugin permet d’ex- traire une image de phase par un traitement numérique simple appliqué à deux ou trois images défocalisées, acquises avec un microscope standard.
4.2.2 Approche expérimentale
La méthode étant détaillée dans l’article (Donnadieu et al., 2008), elle ne sera que brièvement rappelée ci-dessous.
A la base du travail qui va suivre se trouve l’expression de la fonction de transfert sur laquelle on a appliqué des simplifications (4.4). La CTF s’exprime comme suit :
T(q,∆z) = exp(−i χ(q)) = exp(i (−(πCsλ
3
2 q
4+πλ∆zq2))) (4.4)
où λ est la longueur d’onde des électrons, ∆z la valeur de défocalisation de la lentille objectif, Cs est le coefficient d’aberration sphérique de la lentille objectif et q correspond à la distance dans le réseau réciproque.
Pour deux images acquises à des valeurs de défocus différentes −∆ et +∆, en négligeant l’effet des aberrations et en se limitant à une résolution nanométrique, on obtient pour l’image de phase la relation approchée suivante :
ˆ Φ(q) = −1 I0 1 2πλq2 ∆0ˆI(q) ∆z (4.5)
Cette relation (4.5) présente une divergence quand q = 0. Cette singularité peut être éliminée en appliquant un outil mathématique : la régularisation de Tikhonov (Tikhonov, 1963). Cette régu- larisation introduira un paramètre ajustable (que l’on nommera a-value) dans le calcul de l’image de phase. Quand le paramètre de Tikhonov a une valeur minimale, l’image de phase peut être quantitative. Les autres paramètres, étant liés aux paramètres d’acquisition du microscope, sont donc connus par l’utilisateur.
Il est de plus possible d’utiliser cette approche avec une seule image défocalisée. Dans ce cas, l’image de phase reconstruite ne peut pas être quantitative mais elle permet de mieux visualiser les détails en ajustant le paramètre a-value. Cette application qualitative peut présenter un intérêt pour les échantillons produisant des images à faible contraste en TEM.
4.2.3 Résultats
Le développement du plugin est réalisé à partir de l’équation d’origine basée sur l’utilisation de 3 images focales : 2 images symétriquement défocalisées autour d’une image au focus, par exemple : -83nm, 0nm et +83nm.
FIGURE4.5 – Présentation de l’interface utilisateur du plugin SPCI en utilisant deux images en entrée. Le cadre rouge correspond aux entrées des images (cas à 2 et 3 images).
Le plugin a été conçu afin d’exploiter tout type d’images (8bit, 16 bit et 32 bit) et de faire la dis- tinction entre les paramètres expérimentaux et le paramètre ajustable a-value qui est exprimé à la fois en nm−1et en pixel pour une meilleure compréhension de l’utilisation. Le plugin permet de
calculer l’image de phase pour un ensemble de paramètres choisis par l’utilisateur afin d’en visua- liser rapidement les effets, lui permettant ainsi de sélectionner l’image de phase la plus pertinente selon le système étudié.
FIGURE4.6 – Capture d’écran de l’interface utilisateur présentant une image à traiter, le profile du fond de
l’image, l’interface du plugin et les résultats obtenus. Le profil sert à déterminer la valeur moyenne du fond de l’image (1400) afin de paramétrer le plugin.
Durant les tests de validation, la possibilité de n’utiliser que 2 images défocalisées a été ajoutée après avoir constaté que l’image au focus pouvait être remplacée par une image constante corres- pondant à la valeur de fond de l’image déterminée par l’utilisateur. Cette approche a été évaluée de manière quantitative sur des billes d’or dans la section 4.2.1.1 de l’article (Verguet et al., 2019) proposé en annexe.
Le plugin a été appliqué à des images acquises à partir des échantillons biologiques (Trypa-
avérées assez bruitées lorsque la défocalisation n’était pas importante. Au cours de ces tests, on a mis en évidence l’utilisation d’une seule image défocalisée qui, couplée à une valeur de fond, permet d’améliorer le contraste.
FIGURE4.7 – Comparaison du traitement SPCI à une image seule avec le filtre passe-bande pour l’identifi- cation des crêtes mitochondriales. (A) Image brute défocalisée à +83 nm. (B) Image d’application d’un filtre passe-bande. (C) Image de phase résultant d’un traitement SPCI d’une seule image (a-value 0,012 nm−1).
Identification des crêtes mitochondriale par des flèches jaunes. (D) Superposition des images précédentes : image brute (canal rouge), image filtrée passe-bande (canal bleu) et une image de phase reconstruite avec SPCI (canal vert). Des petits points rouges sont présents sur toutes les images, ils correspondent à du bruit de haute fréquence. Ces points sont éliminés après l’application des deux traitements (passe-bande et SPCI une image). Cependant, il convient de noter que le filtre passe-bande est associé à des artefacts représentés par le bleu qui sont absents de l’image verte de traitement une image SPCI. La barre d’échelle est de 50 nm.
Pour mieux évaluer l’intérêt d’un traitement SPCI d’une seule image, il a été comparé (dans l’article (Verguet et al., 2019), annexe C) avec le filtre passe-bande de Fourier qui est largement utilisé. La figure 4.7 est un montage d’images acquises en TEM d’une section de la bactérie E. coli inclus en résine (époxy). On identifie sur la figure 4.7 (A) la mitochondrie, mais le faible contraste et le bruit ne permettent pas de distinguer clairement la crête mitochondriale. Un filtre passe- bande de Fourier permet d’améliorer les contours de la mitochondrie comme le montre la figure 4.7 (B). Le traitement SPCI à une image donne une image de phase (figure 4.7 C) où les bords des mitochondries sont bien préservés. Les principales densités présentes dans la mitochondrie peuvent ainsi être interprétées de manière précise (flèches jaunes sur la figure 4.7).
Cet exemple illustre les différences entre le filtre passe-bande et l’application du traitement SPCI à une image. Cela s’explique par le fait que le filtre passe-bande transmet uniformément les fréquences à l’intérieur de l’intervalle défini par les basses et hautes fréquences, alors que le traitement SPCI à une image est basé sur une simplification de la CTF. Le traitement SPCI à une image permet également une meilleure segmentation comme l’illustre l’image couleur de la 4.7 (D). Il limite également les artefacts de bord souvent associés à l’application du filtre passe-bande, tout en permettant une augmentation du contraste du bord de l’objet.