4.6. 1. Définition

Polymorphisme mononucléotidique : SNP (Single Nucleotide Polymorphisme) Les récents progrès en matière d'analyse de séquences d'ADN et la mise au point de méthodologies à haut débit ont rendu possible l'identification et l'analyse de la variation

nucléotidique à grande échelle.

Le marquage moléculaire par SNP permet de repérer les différences au niveau d'un nucléotide

dans une séquence d'ADN.

Cette technique consiste à hybrider sur l'ADN cible une sonde complémentaire portant une molécule fluorescente (le fluorophore). Chaque sonde est spécifique d'une séquence d'ADN donnée.

La deuxième étape consiste en une élongation par action de la Taq polymérase (PCR). Cette enzyme ajoute à l'extrémité des amorces des oligonucléotides présents dans le milieu de

réaction et libère les fluorophores fixés sur les sondes.

Enfin, une visualisation par excitation et quantification du fluorophore, à une longueur d'onde qui lui est propre, est réalisée. Les individus A et B ne révèlent pas la même fluorescence, il ont donc un polymorphisme au niveau d'un nucléotide.

- Utilisation de la technique

Cette technologie qui permet d'éliminer entièrement les étapes de séparation de taille par électrophorèse présente un potentiel d'automatisation très supérieur aux technologies précédentes (RFLP, RAPD, AFLP, SSR...). Elle peut donc être réalisée à très haut débit. Le marquage SNP ou Snip permet d'obtenir des résultats précis pour différencier des allèles entre individus.

VII.4.6. les marqueurs de type SSR (Polymorphisme de nombre d'unités de répétition (Sort séquenses rpeat)):

VII.4.6. 1. Définition :

Un microsatellite ou séquence microsatellite est une séquence d'ADN formée par une répétition continue de motifs composés de 2 à 10 nucléotides. Cette séquence est également appelée simple sequence repeats (SSR), short tandem repeats(STR), et occasionnellement, sequence tagged microsatellite sites (STMS) ou simple sequence repeat polymorphisms (SSRPs). Ils sont de loin le type de marqueurs STS les plus utilisés.

Les SSR sont de courtes répétitions en tandem, de longueur entre 1 et 10 pb, typiquement 2 ou 3 pb. Les SSR sont très variables et distribués régulièrement le long du génome. Ce type d’ADN répété est commun chez les eucaryotes, le nombre d’unités répétées variant largement parmi les organismes, allant jusqu’à 50 copies de l’unité répétée (Morgante 1993).

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VII.4.6.2. La structure des microsatellites :

Les microsatellites sont constitués, selon cette figure, des régions flanquantes l’une gauche et l’autre droite ; ils comprennent aussi des séquences répétées dites motifs, ces motifs diffèrent d’un individu à l’autre, cette différence détermine le polymorphisme des individus. (Blair et

al, 1999).

Figure 62 : la structure de microsatellites (selon Cirad et supagro ; 2006).

VII.4.6.3. Quelques dates concernent l’historique des microsatellites :

- 1960 -1965 : premières descriptions

- 1980 -1985 : présence dans de nombreux génomes

- 1989 : utilisation en tant que marqueurs génétiques (Jarne. 2012). VII.4.6.4. Cycle de vie d’un microsatellite :

1. la naissance d’un microsatellite dans une région où des variants des séquences

répétitivement simples d’ADN sont présents en nombre important (régions de "cryptic simplicity").

2. L’augmentation progressive d’un même type de motif qui, au-delà d’un certain nombre de

répétitions, verra son taux de mutation augmenter et s’accroîtra en longueur, le taux d’erreur de la polymérase étant alors accru.

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(3)L’importance des pressions évolutives que sont la mutation, la dérive génétique, la

sélection ou la migration peut alors être estimée par le nombre d’allèles, le spectre des fréquences alléliques illustrant alors le portrait d’un locus microsatellite "mature".

(4)Cet accroissement en longueur du microsatellite diminuera à partir d’une valeur maximale

de répétitions, des processus de sélection encore mal définis étant, semble-t-il, impliqué dans cette contrainte de taille.

(5)Des délétions et des mutations ponctuelles interrompant les répétitions entraîneront

finalement la dégénérescence du microsatellite qui reviendra à son stade initial où différents motifs seront mélangés, interrompus et présents en surnombre. La croissance d’un nouveau microsatellite dérivé interviendra à la suite de mutations favorables ayant supprimé ces interruptions. (John. 2006).

VII.4.6.5. Les différentes classes des microsatellites :

Figure 63 : les microsatellites ou SSR ou STR constitués de deux régions flanquantes,

d’unité répétée n foie sur la région répétée. (Morgante et al 1993). VII.4.6.6. Les différents types de microsatellites :

Il y a 4 types de microsatellites, classé selon la répétition des différents couples de base azotée et leurs répétitions.

- Parfaits (AT) 18

- Imparfaits (TA) 4 (AG) 13 - Interrompus (CA) 5 CT (CA) 9

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161

Figure 64 : Exemple d’une séquence microsatellite de type (CA) n à 6.7.8 et 11 allèles. VII.4.6.7. Caractéristiques générales des SSR:

- Les microsatellites sont issus de dérapage au moment de la réplication. Les microsatellites se trouvent aussi bien dans les régions codantes que dans les régions non-codantes, mais ils sont beaucoup plus abondants au sein de ces dernières.

- La transmission génétique de ces séquences suit les lois de Mendel de l'hérédité. - La longueur de ces séquences, c'est-à-dire le nombre de répétitions, est variable d'une

espèce à l'autre, d'un individu à l'autre et d'un allèle à l'autre chez un même individu. - la localisation de ces séquences sur le génome est relativement conservée entre les

espèces.

- Les régions flanquantes des microsatellites servent d'amorces lors de la PCR.

- C’est la paire d’amorce spécifique des bordures droites et gauche du microsatellite qui constituent le marqueur.

- Si les SSR constituent de bons marqueurs moleculaires (reproductibles, codominants et aisés d’utilisation), leur caractérisation initiale est toute foie assez lourde. En effet leur production doit passer d’abord par le clonage et le séquençage de ces éléments répétés.

- Les polymorphismes dans les SSR sont causés par des différences dans le nombre d’unités répétées.

- les microsatellites sont le plus souvent multialléliques. Leur détection est obtenue par PCR du locus contenant la séquence répétée suivie d’une électrophorèse du produit de PCR qui permet de distinguer les allèles en fonction de leur taille (Umar.1996 et Ellegren, 2004).

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VII.4.6.8. Identification des régions des SSR :

Il y a deux façons d’identification des régions des microsatellites :

VII.4.6.8.1. Le cas où les séquences sont disponibles dans les bases des données :

- Identification des séquences contenants des microsatellites - Définition d’amorces spécifiques

- Détection du polymorphisme

VII.4.6.8.2. Le cas où il n’y a aucune séquence disponible de l’ADN dans les bases de